張江國(guó)，汪之沫

(1 深圳市蛇口人民醫(yī)院，廣東深圳518052；2 深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于胃癌、食管癌。近年來隨著我國(guó)居民生活方式改變、人口老齡化加劇等，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1，2]。由于其早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，預(yù)后往往較差。目前，臨床早期篩查結(jié)直腸癌的常用手段有糞便隱血試驗(yàn)、糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)、結(jié)腸鏡檢查等，但糞便隱血試驗(yàn)和免疫化學(xué)試驗(yàn)的敏感性較低，而結(jié)腸鏡檢查雖然是篩查結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢查費(fèi)用較高，難以推廣普及。因此，探索一種敏感性和特異性均較高的早期篩查方法具有重要的臨床意義。糞便DNA檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)篩查惡性腫瘤的新方法，通常檢測(cè)異常骨形態(tài)發(fā)生蛋白3(BMP3)、N-myc下游調(diào)節(jié)基因4(NDRG4)基因甲基化以及Kras突變。國(guó)內(nèi)外已有應(yīng)用糞便DNA檢測(cè)篩查惡性腫瘤的報(bào)道，如通過糞便DNA中異常BMP3基因甲基化篩查肺鱗癌、異常NDRG4基因甲基化篩查胃癌、Kras突變篩查胰腺癌或胃癌等[3]。微小RNA(miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，可參與機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞增殖或凋亡等。近年研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤組織中有多種miRNA異常表達(dá)，并參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miR-135b是miRNA家族中的一員，其在前列腺癌組織中異常表達(dá)，并可用于前列腺癌的早期篩查[4]。已有研究證實(shí)，糞便多靶點(diǎn)DNA、miR-135b表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌早期篩查的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性有限[1]，而聯(lián)合檢測(cè)有可能是最有前景的非侵入性篩查手段。但目前相關(guān)報(bào)道較少。本研究探討糞便多靶點(diǎn)DNA和miR-135b表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年4月～2017年11月深圳市蛇口人民醫(yī)院收治的初診結(jié)直腸癌患者35例(觀察組)。所有患者診斷符合《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2015版)》[2]，入院前未行任何抗腫瘤治療，入院后接受手術(shù)治療，術(shù)后組織病理檢查證實(shí)為結(jié)直腸腺癌。排除合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者，病理學(xué)類型為非腺癌者，入組前接受過任何抗腫瘤治療者。其中，男19例、女16例，年齡47～84歲、平均64歲。同期選擇因胃炎、消化性潰瘍等住院的非腫瘤患者39例(對(duì)照組)，男24例、女15例，年齡24～84歲、平均48歲。兩組性別構(gòu)成比較P>0.05，年齡比較P<0.05。本研究經(jīng)深圳市蛇口人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 糞便多靶點(diǎn)DNA和miR-135b表達(dá)檢測(cè)

1.2.1 糞便多靶點(diǎn)DNA檢測(cè) 取兩組新鮮糞便標(biāo)本，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取糞便DNA，經(jīng)NanoDrop-1000超微量分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以提取的糞便DNA為模板，按人類Kras基因7種突變檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。BMP3、NDRG4基因甲基化引物序列及其探針序列由武漢安思威科技有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：BMP3基因甲基化上游引物5′-GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC-3′，下游引物5′-CGCTACGAAACACTCCGAAA-3′，檢測(cè)探針5′-GACGCGGAGCGGTTTTTTGCG-3′，TaqMan熒光探針FAM-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACTCCGCGTCCGT-C6-NH2；NDRG4基因甲基化上游引物5′-CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG-3′，下游引物5′-GTAACTTCCGCCTTCTACGC-3′，檢測(cè)探針5′-GAC-GCGGAGGTTCGTTTATCG-3′，TaqMan熒光探針FAM-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACTCCGCGT-CCGT-C6-NH2；β-actin上游引物5′-TTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3′，下游引物5′-CACCAACCTCATAACCTTATC-3′，檢測(cè)探針5′-CGCCGAGGATAGTGTTGTGG-3′，TaqMan熒光探針VIC-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACCTCGGCGCG-C6-NH2。PCR反應(yīng)體系共20 μL：1×Loading Buffer 15 μL，500 nmol/L上下游引物各0.5 μL，500 nmol/L檢測(cè)探針1 μL，250 nmol/L熒光探針1 μL，250 μmol/L dNTP 2 μL，Taq酶1 U，F(xiàn)EN1酶150 U，模板DNA 1×103copies。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s、67 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s預(yù)擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，95 ℃ 20 s、53 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，利用熒光標(biāo)記的甲基化基因與內(nèi)參基因得到兩條實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線，設(shè)定熒光閾值，得到ΔCT值(CTBMP3-CTβ-actin或CTNDRG4-CTβ-actin)，甲基化指數(shù)=2-ΔCT×100%。以BMP3、NDRG4基因甲基化指數(shù)均>25%為糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性[5]。

1.2.2 糞便miR-135b表達(dá)檢測(cè) 取兩組新鮮糞便標(biāo)本，采用TRIzol法提取總RNA，經(jīng)NanoDrop-1000超微量分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Green Realtime PCR Master Mix說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由上海英俊生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-135b上游引物5′-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCCACATATACTAAA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物各2 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。將人工合成的miR-135b配制成濃度分別為0.01、0.1、0、10、100、1 000、10 000、100 000 ng/L的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)樣本，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增，得到不同濃度樣本的CT值，以濃度對(duì)數(shù)值為X軸、CT值為Y軸作散點(diǎn)圖，線性擬合后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Y=2.719logX+10.518 4(R2=0.961 8)。將糞便miR-135b的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣本濃度，并量化至1 ng糞便RNA的miRNA copies[4]。

2 結(jié)果

2.1 兩組糞便多靶點(diǎn)DNA、miR-135b表達(dá)比較 觀察組與對(duì)照組糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性例數(shù)分別為23(65.71%)、4例(10.26%)，糞便miR-135b表達(dá)分別為(72.8±18.2)、(34.5±20.0)copies/ng，兩組比較P均<0.01。

2.2 糞便多靶點(diǎn)DNA、miR-135b表達(dá)單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的價(jià)值分析 ROC曲線分析顯示，糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性單獨(dú)檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積為0.78(95%CI：0.68～0.88)，此時(shí)其診斷結(jié)直腸癌的敏感性為70%、特異性為90%；糞便miR-135b表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積為0.86(95%CI：0.80～0.93)，其cut off值為69.9 copies/ng，此時(shí)其診斷結(jié)直腸癌的敏感性為91%、特異性為81%；糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性與miR-135b表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積為0.93(95%CI：0.89～0.98)，其診斷結(jié)直腸癌的敏感性為97%、特異性為74%。糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性與miR-135b表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積明顯高于糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05)，與糞便miR-135b表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)的ROC曲線下面積比較P>0.05。

3 討論

近年來，隨著居民生活方式改變、人口老齡化加劇等，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1，2]。由于其早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，預(yù)后往往較差。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前，臨床早期篩查結(jié)直腸癌的常用手段有糞便隱血試驗(yàn)、糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)、結(jié)腸鏡檢查等。其中，糞便隱血試驗(yàn)早期篩查結(jié)直腸癌的敏感性和特異性均較低；糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)雖然篩查結(jié)直腸癌的敏感性較高，但其特異性較差；結(jié)腸鏡檢查是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但其檢查費(fèi)用較高，難以大規(guī)模推廣。因此，探尋一種價(jià)格低廉且敏感性和特異性均較高的結(jié)直腸癌篩查方法具有重要意義[4]。

糞便DNA檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)篩查惡性腫瘤的新方法，通常檢測(cè)異常BMP3、NDRG4基因甲基化以及Kras突變。國(guó)內(nèi)外已有應(yīng)用糞便DNA檢測(cè)篩查惡性腫瘤的報(bào)道，如通過糞便DNA中異常BMP3基因甲基化篩查肺鱗癌、異常NDRG4基因甲基化篩查胃癌、Kras突變篩查胰腺癌或胃癌等。BMP3、NDRG4基因過度甲基化會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄沉默，從而抑制BMP3、NDRG4蛋白合成，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。Kras是ras基因家族成員，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)作用，如Kras突變時(shí)，該基因會(huì)永久活化，其編碼的ras蛋白異常，可使結(jié)直腸細(xì)胞增殖失控繼而癌變[6，7]。有研究報(bào)道，應(yīng)用糞便BMP3、NDRG4基因甲基化和Kras突變等基因檢測(cè)篩查結(jié)直腸癌的敏感性要明顯高于糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)[8，9]。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA。近年研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤組織中存在多種miRNA異常表達(dá)，并參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miR-135b是miRNA家族中的一員，其在胃癌、骨肉瘤等實(shí)體腫瘤中表達(dá)明顯升高。miR-135b能夠靶向抑制抑癌基因APC表達(dá)，故其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10,11]。Wu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，糞便miR-135b表達(dá)篩查結(jié)直腸癌的敏感性為78%、特異性為68%，提示糞便miR-135b表達(dá)檢測(cè)可作為篩查結(jié)直腸癌的非侵入性手段之一。糞便BMP3、NDRG4基因甲基化異常和Kras突變能夠在轉(zhuǎn)錄水平上反映腫瘤細(xì)胞存在，而糞便miR-135b表達(dá)異常能夠在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控水平上反映腫瘤細(xì)胞存在。但已有研究證實(shí)，糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性、miR-135b表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌早期篩查的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性有限，而聯(lián)合檢測(cè)有可能是最有前景的非侵入性篩查手段。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性例數(shù)明顯高于對(duì)照組，糞便miR-135b表達(dá)亦明顯高于對(duì)照組，表明結(jié)直腸癌患者存在糞便多靶點(diǎn)DNA甲基化和miR-135b表達(dá)異常，有可能成為結(jié)直腸癌篩查的指標(biāo)。

由于表觀遺傳修飾是對(duì)環(huán)境壓力的一種動(dòng)態(tài)反應(yīng)，BMP3、NDRG4基因超甲基化和Kras突變可能存在腫瘤細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的表觀遺傳異質(zhì)性[12～14]，故單分子表觀遺傳學(xué)檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性較低。結(jié)直腸癌組織miR-135b表達(dá)可能亦存在異質(zhì)性，因此單獨(dú)檢測(cè)糞便miR-135b表達(dá)診斷結(jié)直腸癌的效能可能較低[15，16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性單獨(dú)檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積為0.78，其診斷敏感性為70%、特異性為90%，與Cooper等[14]研究結(jié)果相似；糞便miR-135b表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積為0.86，其cut off值為69.9 copies/ng，此時(shí)其診斷敏感性為91%、特異性為81%，略高于Wu等[4]的研究結(jié)果，可能是由于Wu等[4]的研究隊(duì)列中包括IBD患者，從而影響了糞便miR-135b表達(dá)診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性與miR-135b表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積明顯高于糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性單獨(dú)檢測(cè)，提示糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性與miR-135b表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)較糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性單獨(dú)檢測(cè)具有更好的診斷效能；糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性與miR-135b表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積雖高于糞便miR-135b表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是糞便多靶點(diǎn)DNA陽(yáng)性與miR-135b表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能與糞便miR-135b表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)的診斷效能確實(shí)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也可能是由于病例的局限性，聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能未能得到充分發(fā)揮，尚需進(jìn)一步臨床研究驗(yàn)證。

綜上所述，糞便多靶點(diǎn)DNA和miR-135b表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能較高，有可能作為結(jié)直腸癌早期篩查的方法在臨床中推廣應(yīng)用。