張 濤，曾凌竹

(重慶三峽中心醫(yī)院，重慶 404000)

腦卒中是一種中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，隨著我國老齡化的加劇，預(yù)后和治療高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的腦卒中已刻不容緩。缺血性腦卒中是腦卒中的主要病理類型，其與神經(jīng)細胞凋亡、興奮性中毒、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種發(fā)病機制有關(guān)[1-2]。Toll樣受體4(TLR4)是Toll樣受體家族中研究較多的成員，可通過多種途徑參與細胞凋亡、免疫和炎癥反應(yīng)，在機體抵抗病原體感染或組織損傷方面發(fā)揮著積極作用，與神經(jīng)細胞疾病、免疫性疾病、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。右美托咪定是一種有效的α2-腎上腺素受體激動劑，也是臨床上輔助患者鎮(zhèn)靜和全身麻醉的常用藥物。前人研究[6-7]已證實右美托咪定對神經(jīng)功能損傷具有較好的保護作用，但其有無介導(dǎo)TLR4表達參與神經(jīng)細胞損傷的保護機制尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建氧糖剝奪損傷細胞模型，從炎癥反應(yīng)上分析右美托咪定調(diào)控TLR4表達對神經(jīng)細胞氧糖剝奪損傷的保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

PC12細胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。以0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集第3代長勢良好的對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

右美托咪定購于江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，Trizol試劑、TLR4抑制劑TAK-242購于美國Takeda公司SYBR Premix Ex TaqⅡ購于北京聚合美生物公司，Bax抗體和Bcl-2抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，TLR4抗體和β肌動蛋白(β-actin)抗體購于美國Proteintech公司。辣根酶標記的二抗購于北京中杉金橋公司。細胞裂解液、CCK-8試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，BCA法蛋白含量檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒和和白細胞介素-6(IL-6)ELISA 試劑盒購于美國R&D公司。CO2細胞培養(yǎng)箱購于美國Forma公司，酶標儀和凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司，有機玻璃密閉缺氧箱為自制。PCR儀購于上海賽默生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

將對數(shù)生長期的PC12細胞隨機分為對照組：正常培養(yǎng)，模型組：制備氧糖剝奪模型，右美托咪定低、中和高劑量組：在氧糖剝奪模型基礎(chǔ)上給予終濃度為0.1、1.0和10.0 μmol/L右美托咪定。后期實驗分為模型組：制備氧糖剝奪模型，抑制劑組：在氧糖剝奪模基礎(chǔ)上給予終濃度為30 μmol/L TLR4抑制劑TAK-242，抑制劑+右美托咪定組：在氧糖剝奪?；A(chǔ)上給予終濃度為30 μmol/L TLR4抑制劑TAK-242和終濃度為10 μmol/L 右美托咪定。

1.3.2 氧糖剝奪細胞模型的建立

采用無血清、無糖的pH 7.2的洛克緩沖液(5.6 mmol/L KCl+154 mmol/L NaCl+1 mmol/L MgCl2+2.3 mmol/L CaCl2+3.6 mmol/L NaHCO3+6 mmol/L HEPES+5 mg/mL 慶大霉素)培養(yǎng) PC12細胞，先置于含5% CO2和95%N2的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，再置于含5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。右美托咪定處理組在氧糖剝奪及復(fù)糖氧過程中均采用含相應(yīng)濃度的右美托咪定培養(yǎng)基。

1.3.3 細胞存活率的測定

取對數(shù)生長期的PC12細胞，在96孔板上接種細胞濃度為5×104個/mL的細胞懸液200 μL/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁75%時，參照1.3中的分組及1.4中的處理進行操作，每組設(shè)置5個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑10 μL孵育1 h。以酶標儀檢測450 nm波長處各組細胞的吸光度(OD)值，以無細胞的培養(yǎng)液調(diào)零，并根據(jù)公式：細胞存活率=100%×(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)計算各組細胞的存活率。每組細胞測定3次。

1.3.4 Western blot檢測

收集各組PC12細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白后，采用BCA法對總蛋白樣品進行濃度的定量。以每孔50 μg蛋白樣品進行凝膠電泳分離，濃縮膠電壓設(shè)為80 V，分離膠單壓設(shè)為120 V。電泳結(jié)束后，將蛋白凝膠轉(zhuǎn)至NC膜，置于封閉液中常溫封閉2 h。加入稀釋比例為1∶1000的特異性一抗(Bax、Bcl-2、TLR4和β-actin)搖床4℃下孵育24 h。封閉液洗膜3次后，加入稀釋比例為1∶2000的二抗搖床37℃孵育1 h。參照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒暗室中顯色、曝光，以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白的相對表達水平。每組細胞測定3次。

1.3.5 RT-PCR檢測

采用Trizol法提取PC12細胞的總RNA，定量RNA純度后，以其作為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再取2.5 μL cDNA作模板，加入各1 μL上下游引物、12.5 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)和8 μL 無核酸酶水配制25 μL的PCR反應(yīng)體系，設(shè)定PCR儀的三個階段的反應(yīng)條件分別為1)94℃ 5 min，2)94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min，3)72℃ 5 min。其中第二階段循環(huán)35次。TLR4引物上游序列為5’-GATTGCTCAGACATGGCA -GT-3’，下游序列為5’-CCCACTCGAGGTAGGTGTTT-3’，內(nèi)參β-actin引物上游序列5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游序列為5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，均由上海生工生物公司合成。采用2-△△Ct法檢測各組細胞中TLR4 mRNA的相對表達水平。每組細胞測定3次。

1.3.6 ELISA檢測

每組取100 μL細胞上清液，參照TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書步驟檢測各組細胞的TNF-α和IL-6含量。每組細胞測定3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對PC12細胞增殖的影響

對照組、模型組以及右美托咪定低、中和高劑量組細胞中細胞存活率分別為(92.88±11.25)%、(58.62±6.76)%、(75.85±7.05)%、(81.24±5.65)%和(88.76±6.93)%，五組整體比較差異有顯著性(F=8.907,P=0.003 與對照組細胞存活率相比，經(jīng)氧糖剝奪處理后的模型組細胞的存活率明顯降低(P<0.05)。給予低、中和高劑量的右美托咪定處理后，PC12細胞的存活率分別與模型組相比，均明顯升高(P<0.05)，且呈濃度依賴性(t1=2.716，t2=3.565，t3=4.751，P<0.05)。結(jié)果見圖1。

注：1：對照組；2：模型組；3：右美托咪定低劑量組；4：右美托咪定中劑量組；5：右美托咪定高劑量組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖1 右美托咪定對PC12細胞增殖的影響Note. 1: Control group; 2: Model group; 3: Dexmedetomidine low dose group; 4: Dexmedetomidine medium dose group; 5: Dexmedetomidine high dose group. Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.Figure 1 Effect of dexmedetomidine on the proliferation of PC12 cells

2.2 右美托咪定對PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達的影響

Western blot檢測對照組、模型組以及右美托咪定低、中和高劑量組細胞中Bax蛋白的相對表達量分別為0.18±0.02、1.22±0.08、0.85±0.05、0.37±0.03和0.22±0.02，Bcl-2蛋白的相比表達量分別為0.83±0.06、0.23±0.02、0.35±0.03、0.46±0.02和0.55±0.03。對照組、模型組以及右美托咪定低、中和高劑量組細胞中Bax蛋白和Bcl-2蛋白的相比表達量分別整體比較差異有顯著性(FBax=288.495，PBax<0.05；FBcl-2=125.274，PBcl-2< 0.05)。與對照組相比，模型組細胞中Bax蛋白表達明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，右美托咪定低、中和高劑量組中Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)，且呈現(xiàn)濃度依賴性改變。結(jié)果見圖2。

2.3 右美托咪定對PC12細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的影響

氧糖剝奪后PC12細胞、對照組、右美托咪定低、中和高濃度處理組中TNF-α含量分別為(865.38±52.16)pg/mL、(328.76±37.45)pg/mL、(668.95±27.56)pg/mL、(611.52±25.48)pg/mL和(573.46±22.37)pg/mL，IL-6含量分別為(235.42±23.16)pg/mL、(128.65±11.58)pg/mL、(188.73±18.25)pg/mL、(171.55±20.47)pg/mL和(154.32±12.64)pg/mL，分別整體比較差異有顯著性(FTNF-α=92.704，PTNF-α<0.05;FIL-6=15.225，PIL-6<0.05)氧糖剝奪后PC12細胞上清液中TNF-α含量IL-6含量明顯高于對照組中TNF-α含量IL-6含量(P<0.05)，右美托咪定各濃度處理組均能夠降低氧糖剝后TNF-α和IL-6含量(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

2.4 右美托咪定對PC12細胞中TLR4 mRNA和蛋白的表達

RT-PCR檢測對照組、模型組、右美托咪定低劑量組、右美托咪定中劑量組和右美托咪定高劑量組細胞中TLR4 mRNA的相對表達量分別為1.23±0.09、5.45±0.48、4.15±0.39、2.95±0.30和1.78±0.18，整體比較差異有顯著性(F=86.887,P<0.05)結(jié)果見圖4A；Western blot檢測各組細胞中TLR4蛋白的相對表達量分別為0.15±0.02、1.18±0.25、0.75±0.06、0.42±0.03和0.28±0.02，整體比較差異有顯著性(F=37.971,P<0.05)結(jié)果見圖4B和4C。與對照組相比，模型組細胞中TLR4 mRNA和蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)，而右美托咪定低劑量組、右美托咪定中劑量組和右美托咪定高劑量組中TLR4 mRNA和蛋白的表達水平較模型組均呈濃度依賴性降低，且差異有顯著性(P<0.05)。

注：A：Western blot檢測結(jié)果，B：Bax和Bcl-2蛋白的相對表達量。1：對照組；2：模型組；3：右美托咪定低劑量組；4：右美托咪定中劑量組；5：右美托咪定高劑量組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖2 各組細胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達Note. A: Result of Western blot. B: Relative expressions of Bax and Bcl-2 proteins. 1: Control group; 2: Model group; 3: Dexmedetomidine low dose group; 4: Dexmedetomidine medium dose group; 5: Dexmedetomidine high dose group. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.Figure 2 Expression of Bax and Bcl-2 proteins in cells from each group

注：A：TNF-α含量；B：IL-6含量。1：對照組；2：模型組；3：右美托咪定低劑量組；4：右美托咪定中劑量組；5：右美托咪定高劑量組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖3 右美托咪定對TNF-α和IL-6的影響Note: A: TNF-α content. B: IL-6 content. 1: Control group; 2: Model group; 3: Dexmedetomidine low dose group; 4: Dexmedetomidine medium dose group; 5: Dexmedetomidine high dose group. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.Figure 3 Effect of dexmedetomidine on TNF-α and IL-6 levels

2.5 右美托咪定調(diào)控TLR4表達對PC12細胞的影響

模型組、抑制劑組和抑制劑+右美托咪定組細胞的存活率分別為(63.76±5.53)%、(76.22±4.15)%和(89.65±5.36)%，Bax蛋白的相對表達量分別為1.18±0.09、0.48±0.03和0.24±0.02，Bcl-2蛋白表達量分別為0.26±0.03、0.55±0.04和0.89±0.06，TLR4蛋白的表達量分別為0.92±0.06、0.42±0.05和0.13±0.02，TNF-α含量分別為(887.26±39.25)pg/mL、(695.48±22.16)pg/mL和(426.18±25.42)pg/mL，IL-6含量分別為(245.68±22.25)pg/mL、(188.46±21.15)pg/mL和(117.85±18.65)pg/mL。模型組、抑制劑組和抑制劑+右美托咪定組分別整體比較差異均有顯著性(F存活率=19.715，P存活率<0.05；FBax=228.383，PBax<0.05；FBcl-2=146.705，PBcl-2<0.05；FTLR4=221.123，PTLR4<0.05；FTNF-α=180.063，PTNF-α<0.05；FIL-6=28.601，PIL-6<0.05)。給予30 μmol/L TLR4抑制劑處理后，PC12細胞的存活率和Bcl-2蛋白表達升高，Bax和TLR4蛋白表達以及TNF-α和IL-6含量降低；給予10 μmol/L右美托咪定處理后，TLR4抑制劑對PC12細胞的存活率、Bcl-2蛋白、Bax蛋白、TLR4蛋白表達以及TNF-α、IL-6含量的調(diào)控作用明顯增強，結(jié)果見圖5。

注：A：RT-PCR檢測結(jié)果；B：Western blot檢測結(jié)果；C：TLR4蛋白的相對表達量。1：對照組；2：模型組；3：右美托咪定低劑量組；4：右美托咪定中劑量組；5：右美托咪定高劑量組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖4 各組細胞中TLR4 mRNA和蛋白的表達Note. A: Results of RT-PCR detection. B: Western blot test results. C: Relative expression of TLR4 protein. 1: Control group; 2: Model group; 3: Dexmedetomidine low dose group; 4: Dexmedetomidine medium dose group; 5: Dexmedetomidine high dose group. Compared with the control group, *P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.Figure 4 Expression of TLR4 mRNA and protein in cells from each group

3 討論

注：A：細胞存活率；B：Western blot檢測結(jié)果；C：蛋白的相對表達量；D：TNF-α和IL-6含量。1：模型組；2：抑制劑組；3：抑制劑+右美托咪定組。與模型組相比，*P<0.05；與模型+抑制劑組相比，#P<0.05。圖5 右美托咪定調(diào)控TLR4表達對PC12細胞的影響Note. A: Cell survival rate. B: Result of Western blot. C: Relative expression of protein. D: TNF-α and IL-6 levels. 1: Model group; 2: Inhibitor group; 3: Inhibitor + dexmedetomidine group. Compared with the model group,*P<0.05. Compared with the model + inhibitor group,#P<0.05.Figure 5 The effect of dexmedetomidine on the expression of TLR4 in PC12 cells

我國腦卒中的發(fā)病率有明顯升高和年輕化的趨勢，而目前對于腦卒中導(dǎo)致的患者癱瘓、感覺和認知功能障礙以及死亡仍然缺乏有效的治療手段，探討腦卒中的發(fā)病機制，尋找有效的治療藥物及靶點是腦卒中疾病研究的熱點[8-10]。右美托咪定是一種麻醉輔助藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抑制交感神經(jīng)的作用，其可通過調(diào)控細胞凋亡、細胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種途徑改善組織缺血再灌注損傷。例如：右美托咪定可通過抑制caspase-3活性抑制細胞凋亡，改善腎缺血再灌注損傷[11]；還可通過調(diào)控NLRC5缺陷小鼠細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和氧化應(yīng)激因子iNOS表達反應(yīng)參與肝缺血/再灌注損傷的保護作用[12]。TLR4是一種重要的模式識別受體，可通過調(diào)控下游NF-κB信號通路和TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[13-14]；作為一種廣泛存在于腦組織不同細胞的受體分子，TLR4已被證實可通過調(diào)控NF-κB信號通路引起腦神經(jīng)細胞的炎癥損傷和凋亡[15-16]。有報道[17-18]指出，右美托咪定可作為神經(jīng)保護劑，抑制海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡和上調(diào)HSP70表達改善腦損傷；同時，右美托咪定可通過調(diào)控TLR4表達改善心肌缺血/再灌注損傷，但右美托咪定有無介導(dǎo)TLR4表達參與保護神經(jīng)細胞損傷的分子機制并不清楚。

為了探討相關(guān)機制，本研究通過構(gòu)建氧糖剝奪細胞模型，以低、中和高劑量右美托咪定作用PC12神經(jīng)細胞，采用CCK-8法檢測細胞存活率，Western blot檢測促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2表達，ELISA法檢測炎癥因子TNF-α和IL-6含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能夠呈濃度依賴性提高PC12細胞存活率，并下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2表達，降低TNF-α和IL-6含量。結(jié)果表明，右美托咪定可通過促進神經(jīng)細胞增殖、抑制神經(jīng)細胞凋亡及減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮改善神經(jīng)細胞損傷的作用，這一結(jié)果與龔輝等[19]發(fā)現(xiàn)的右美托咪定改善大鼠腦缺血再灌注損傷的機制相吻合。我們通過RT-PCR和Western blot進一步檢測發(fā)現(xiàn)，PC12細胞中TLR4 mRNA和蛋白的表達均隨右美托咪定濃度的升高而降低。結(jié)果提示，右美托咪定可能通過抑制TLR4表達參與神經(jīng)細胞損傷的保護作用。已有研究[20-21]證實，TLR4可調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡，在TLR4基因敲除的小鼠腦組織神經(jīng)元細胞神經(jīng)元凋亡指數(shù)和Bax/Bcl-2比值升高；另外，TLR4的激活可促進炎癥因子TNF-α和IL-6的表達。為了驗證右美托咪定通過抑制TLR4表達參與神經(jīng)細胞損傷的保護機制這一結(jié)果，我們采用30 μmol/L TLR4抑制劑TAK-242抑制TLR4表達后，觀察發(fā)現(xiàn)PC12細胞的存活率、凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達以及炎癥因子TNF-α和IL-6含量的變化趨勢與右美托咪定作用的結(jié)果相一致；同時在抑制TLR4表達基礎(chǔ)上，給予10 μmol/L右美托咪定作用后，TLR4抑制劑的作用明顯增強。結(jié)果證實，右美托咪定通過抑制TLR4表達參與神經(jīng)細胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等過程，進而發(fā)揮保護作用。

總之，我們從細胞水平上證實了右美托咪定可改善神經(jīng)細胞氧糖剝奪損傷，其可通過抑制TLR4表達參與及其神經(jīng)細胞的保護作用。該結(jié)果為右美托咪定有效治療缺血性腦損傷提供了新的依據(jù)，也為TLR4有望成為缺血性腦損傷的治療靶點提供了參考依據(jù)。