彭麗娜，寧尚斌，王光光，常世民，張玉峰，李艷霞

(廊坊師范學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)教研室，河北 廊坊 065000)

線(xiàn)粒體呼吸鏈(respiratory chain)的作用是線(xiàn)粒體的最基本功能。線(xiàn)粒體呼吸鏈又稱(chēng)電子傳遞鏈，由線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的電子載體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ即呼吸鏈酶RCCI～RCCIV構(gòu)成，主要接受代謝物NADH和FADH2脫下的氫或電子，經(jīng)過(guò)復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ中NAD+、NADP+和FAD載體傳遞給氧生成水并釋放ATP的過(guò)程。線(xiàn)粒體呼吸鏈酶缺陷是造成很多疾病的源泉[1]。腎主骨生髓，乃先天之本，生命之根，君主之官。腎功能健全是保證機(jī)體機(jī)能正常運(yùn)轉(zhuǎn)的根本[1]。腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶的活性直接影響能量輸出ATP時(shí)傳遞氫離子或是電子的速率，影響腎功能[2]。實(shí)驗(yàn)證明，瑪咖能顯著降低線(xiàn)粒體丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，提高老齡小鼠心、肝組織血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，具有緩解體力疲勞的功能[3-4]。課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，瑪咖可以提高老齡大鼠腎、腦組織線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性和提高抗衰老能力；也可以改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌組織ATP的消耗，緩解心肌損傷的發(fā)生[5-7]。在前期研究成果的基礎(chǔ)上，本文探討補(bǔ)充瑪咖結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法對(duì)老齡糖尿病大鼠腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性及腎功能的影響，為機(jī)體能量代謝性疾病及預(yù)防、康復(fù)手段提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體重(450 ± 20) g，12月齡。購(gòu)于北京維通利華[SCXK (京) 2016-0001]。大鼠飼養(yǎng)于本單位動(dòng)物房[SYXK (冀) 2016-0011]，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，溫度25℃左右，每周進(jìn)行一次紫外燈消毒。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理相關(guān)規(guī)定和要求，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素、NADH、魚(yú)藤酮、細(xì)胞色素C、抗霉素、阿霉素等為Sigma公司產(chǎn)品；硫脲、硼酸、鄰甲苯胺、冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖等藥品為國(guó)產(chǎn)；血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血糖試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。北京信康億達(dá)YDX-3液氮罐、YQ-3型電動(dòng)勻漿機(jī)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich 320/320R)；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津UVmini-124)；大鼠跑臺(tái)(杭州)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模

高糖高脂飼料喂養(yǎng)一個(gè)月后腹腔注射鏈佐霉素(40 mg/kg，用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液溶解，pH=4.0)，每天一次，連續(xù)4 d。兩天后再按照100 mg/kg劑量腹腔注射四氧嘧啶水溶液[8-9]。造模成功后，保留40只模型大鼠。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與瑪咖干預(yù)

一個(gè)月后淘汰模型失敗及死亡大鼠，最終保留40只大鼠參與模型實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成4組，每組10只，分為模型對(duì)照組、瑪咖組、運(yùn)動(dòng)組和瑪咖+運(yùn)動(dòng)組。根據(jù)國(guó)內(nèi)大鼠運(yùn)動(dòng)模型[10]，運(yùn)動(dòng)和瑪咖+運(yùn)動(dòng)兩組動(dòng)物進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練(每周5 d，每天一次)，速度從12 m/min遞增到27 m/min，每周遞增3 m/min；時(shí)間從20 min遞增到45 min，每周遞增5 min。瑪咖組和瑪咖+運(yùn)動(dòng)組大鼠每次運(yùn)動(dòng)后以5 g/kg瑪咖粉[11]給予大鼠灌胃。一個(gè)半月訓(xùn)練結(jié)束后所有動(dòng)物(除模型對(duì)照組)以運(yùn)動(dòng)速度35 m/min[10]運(yùn)動(dòng)至力竭。

1.3.3 腎標(biāo)本制備及線(xiàn)粒體的提取

力竭后即刻麻醉取血并解剖取出雙腎，冰浴中除去結(jié)締組織并剪成碎塊制成勻漿液(1∶5加入緩沖液)。勻漿液兩次離心(600 r/min，15 min)，棄沉淀，取上清；懸浮后再離心(12 000 r/min，15 min)，棄上清，留固體沉淀，再次與250 mmol/L蔗糖等懸浮液混合后再離心(12 000 r/min，15 min)，沉淀物即為腎線(xiàn)粒體[12]。

1.3.4 腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性及血尿素氮、血清肌酐、血糖水平的測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定蛋白含量。形態(tài)學(xué)指標(biāo)采用甲醛固定，HE染色，光鏡下觀(guān)察結(jié)構(gòu)變化。在25℃室溫下，測(cè)定腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性。將10 μL線(xiàn)粒體蛋白加入到酶RCCI～RCCIV反應(yīng)緩沖液2 mL中，連續(xù)測(cè)定3 min內(nèi)NADH、FADH2、細(xì)胞色素C還原酶與細(xì)胞色素C氧化酶340、600、550、550 nm處吸光值的變化表示腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶RCCI～RCCIV的活性[13]。血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血糖的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒的操作程序進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎線(xiàn)粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

光鏡下放大1500倍觀(guān)察線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)顯示，糖尿病大鼠腎線(xiàn)粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)不一。對(duì)照組腎線(xiàn)粒體呈現(xiàn)壞死、腫脹、斷裂、紊亂、異常、界限間隙增加；瑪咖組線(xiàn)粒體排列較對(duì)照組線(xiàn)粒體腫脹、損傷、斷裂、變性情況有所減輕，界限稍明顯；運(yùn)動(dòng)組和瑪咖組類(lèi)似，線(xiàn)粒體排列界限模糊、紊亂，腫脹、損傷、斷裂、變性程度仍很大，但相對(duì)于對(duì)照組有所改善；瑪咖+運(yùn)動(dòng)組腎線(xiàn)粒體病理有明顯改善，結(jié)構(gòu)排列比前三組緊密、紋理稍清晰、整齊，壞死、腫脹、斷裂情況明顯好轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖1。

注：A：對(duì)照組；B：瑪咖組；C：運(yùn)動(dòng)組；D：瑪咖+運(yùn)動(dòng)組。圖1 各組大鼠腎線(xiàn)粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化(×1500)Note. A: Control group; B: Maca group; C: Training group; D: Maca + training group.Figure 1 Morphological and structural changes of mitochondria in rat kidneys of each group

2.2 各組大鼠腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性的變化

與對(duì)照組比較，瑪咖組大鼠腎線(xiàn)粒體呼吸鏈RCCI、RCCIII、RCCIV活性分別提高14.14%、11.92%和18.42%(P> 0.05)，RCCII活性提高32.86%(P< 0.01)；與對(duì)照組比較，運(yùn)動(dòng)組RCCI、RCCII活性分別提高36.81%和26.12%(P< 0.01或P< 0.05)，RCCIII、RCCIV活性分別提高8.73%和12.51%(P> 0.05)；與對(duì)照組比較，瑪咖+運(yùn)動(dòng)組RCCI、RCCII、RCCIV活性分別提高48.21%、38.89%和25.10%(P< 0.01或P< 0.05)，RCCIII活性提高14.89%(P> 0.05)。與瑪咖組比較，瑪咖+運(yùn)動(dòng)組RCCI、RCCII活性分別提高39.68%和31.18%(P< 0.01)，RCCIII、RCCIV活性分別提高3.37%和8.18%(P> 0.05)。與運(yùn)動(dòng)組比較，瑪咖+運(yùn)動(dòng)組RCCI、RCCIII、RCCIV活性分別提高18.05%、6.74%和14.39%(P> 0.05)，RCCII活性提高37.46%(P< 0.01)。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠腎功能的變化

與對(duì)照組比較，瑪咖組、瑪咖+運(yùn)動(dòng)組大鼠血尿素氮含量分別降低25.37%和35.47%(P< 0.05或P< 0.01)，運(yùn)動(dòng)組降低17.65%(P> 0.05)；與對(duì)照組比較，瑪咖組血清肌酐降低18.86%(P> 0.05)，運(yùn)動(dòng)組、瑪咖+運(yùn)動(dòng)組分別降低25.20%和38.66%(P< 0.05或P< 0.01)；與對(duì)照組比較，瑪咖組血糖水平降低18.15%(P> 0.05)，運(yùn)動(dòng)組、瑪咖+運(yùn)動(dòng)組分別降低28.13%和45.28%(P< 0.05或P< 0.01)。與瑪咖組比較，瑪咖+運(yùn)動(dòng)組血尿素氮含量降低13.54%(P> 0.05)，血清肌酐、血糖水平分別降低24.39%、33.14%(P< 0.05或P< 0.01)。與運(yùn)動(dòng)組相比，瑪咖+運(yùn)動(dòng)組血尿素氮、血糖水平分別降低21.65%、23.86%(P< 0.05)，血清肌酐含量降低17.99%(P> 0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 各組大鼠腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性的變化

研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以改善胰島素抵抗、提高血管內(nèi)皮功能、提高線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性及抗氧化酶活性，降低血糖水平及炎癥的發(fā)生[14-16]。也有研究表明，瑪咖結(jié)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以提高老年大鼠腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性，降低大鼠線(xiàn)粒體MDA含量，防治線(xiàn)粒體功能的退行性變化，延緩機(jī)體衰老[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一個(gè)半月有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、瑪咖干預(yù)、瑪咖+運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可改善糖尿病大鼠腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性，提高機(jī)體能量代謝速率，且瑪咖+運(yùn)動(dòng)組效果更加顯著。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于瑪咖結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法在改善糖尿病大鼠線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性中，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)呼吸鏈的起始酶——FADH2還原酶(RCCII)最為敏感，而補(bǔ)充瑪咖主要影響NADH還原酶(RCCI)。分析其機(jī)制可能是糖尿病大鼠本身的腎組織處于高代謝狀態(tài)，腎小球內(nèi)壓及濾過(guò)率加大，腎小球的硬化速度加快及部分出現(xiàn)增值肥大[17-18]，電解質(zhì)、體液失衡，細(xì)胞外基質(zhì)增加，甘油三酯脂酶、NADH還原酶等活性下降，造成機(jī)體免疫力下降[19]；而有氧運(yùn)動(dòng)可以提高脂蛋白脂酶的活性，增加β-細(xì)胞胰島素分泌，降低由于糖脂超載而造成的血管壓力，減輕由于機(jī)體代謝紊亂而造成的機(jī)體損害[20]，減輕腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)纖維化，降低腎小球內(nèi)壓及濾過(guò)率，F(xiàn)ADH2還原酶作為呼吸鏈的啟動(dòng)酶系傳遞電子或H+功能加強(qiáng)，提高腎線(xiàn)粒體產(chǎn)生良性適應(yīng)，氧化磷酸化功能倍增[21]；另外，瑪咖中含有豐富的瑪咖烯、瑪咖酰胺、芥子油苷、生物堿等調(diào)節(jié)腎上腺、胰腺等功能，平衡荷爾蒙分泌，加強(qiáng)腎活力[22]；瑪咖中還含有亞油酸、亞麻酸、牛黃酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸，鐵、鋅等營(yíng)養(yǎng)成分，能加固免疫系統(tǒng)，清除過(guò)量的自由基，調(diào)節(jié)腎線(xiàn)粒體內(nèi)膜NADPH氧化酶活性[23]，防止胰島素抵抗，減輕受損腎細(xì)胞修復(fù)，降低腎耗氧量，提高腎產(chǎn)能速率，延緩機(jī)體疲勞及衰老速度、激活腎功能來(lái)提高線(xiàn)粒體能量代謝[24]。總之，補(bǔ)充瑪咖結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法可提高糖尿病大鼠腎線(xiàn)粒體呼吸功能，提高機(jī)體能量輸出速率。

表1 各組大鼠腎線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性的變化Table 1 Changes in mitochondria respiratory chain enzyme activities in rat kidneys of each group

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與瑪咖組比較，##P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the Maca group,##P< 0.01.

表2 各組大鼠腎功能的變化Table 2 Changes in renal function of rats in each group

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與瑪咖組比較，#P< 0.05。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the Maca group,#P< 0.05.

3.2 各組大鼠腎功能的變化

血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血糖是檢查腎功能的常用指標(biāo)，但易受各種因素的影響，如攝入高脂、高糖、高蛋白食物，飲酒、情緒波動(dòng)等均可使血尿素氮、血清肌酐、血糖水平升高[17-18]。研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)能有效降低糖尿病大鼠血尿素氮水平和血糖含量，改善大鼠糖、脂代謝和胰島素抵抗，提高腎線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)，減輕腎功能損傷[25]。另一研究表明，瑪咖干預(yù)可提高機(jī)體抗疲勞能力[3]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，運(yùn)動(dòng)療法、瑪咖干預(yù)、運(yùn)動(dòng)+瑪咖干預(yù)均可降低糖尿病大鼠血尿素氮、血清肌酐、血糖水平，且運(yùn)動(dòng)療法結(jié)合瑪咖干預(yù)組效果大于另外兩組；本實(shí)驗(yàn)還顯示，補(bǔ)充瑪咖主要影響血尿素氮含量，而在改善血清肌酐和血糖水平方面效果并不顯著，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可以明顯降低血清肌酐、血糖水平，但在改善血尿素氮方面并不十分理想。

分析其機(jī)制可能是腎病理刺激加上大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的雙重刺激，使得腎線(xiàn)粒體MDA、ROS、H2O2等產(chǎn)物增加[17]，導(dǎo)致線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性及糖酵解酶活性下降，線(xiàn)粒體DNA缺失加大，引起線(xiàn)粒體功能障礙，ATP合成能力受阻所致[26]；而長(zhǎng)期科學(xué)的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以增加胰島素敏感性，增強(qiáng)與受體的親和力，降低低密度脂蛋白膽固醇，提高機(jī)體免疫力[27]；同時(shí)，線(xiàn)粒體功能損害在糖尿病中起著重要的作用，血尿素氮、血清肌酐、血糖紊亂可以引起線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能上的改變，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)結(jié)合瑪咖本身具有的抗氧化活性的雙重效應(yīng)可以調(diào)節(jié)血管通透性，維持腎小球及線(xiàn)粒體膜結(jié)構(gòu)功能完整性，清除自由基，減少腎小管的重吸收及清除率[28]，降低血糖及VEGF-A和VEGFR2蛋白水平，提高長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A活性，減少血脂，減輕大鼠腎損傷，提高機(jī)體免疫力及改善糖尿病大鼠腎功能[29]。

總之，糖尿病的發(fā)病機(jī)制很多，應(yīng)該根據(jù)腎病理結(jié)合血液、尿液、遺傳病史以及臨床癥狀等多方面因素加以考慮，對(duì)癥下藥。本實(shí)驗(yàn)方案依據(jù)運(yùn)動(dòng)結(jié)合營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑從能量代謝性疾病方面來(lái)改善糖尿病大鼠腎功能，為預(yù)防疾病和臨床康復(fù)提供參考。但糖尿病患者要注意運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、時(shí)間、膳食以及心情，制定適合自己的運(yùn)動(dòng)方案，達(dá)到運(yùn)動(dòng)降糖、降壓、減脂、提高心肺及腎功能，減少藥物攝入，改善糖尿病患者癥狀的目的。