黃 紅，姜 寧，呂靜薇，楊玉潔，陳碧清，王 瓊，劉新民*，呂光華，4*

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川 瀘州 646000； 4.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都 611137)

疲勞是一種漸進性主觀感受，造成疲勞的原因可分為生理性(即運動性)和心理性。生理(運動)疲勞是肌肉暫時無法保持最佳的身體機能，并且會隨著劇烈的運動而越發(fā)嚴重的狀態(tài)[1-3]。根據(jù)1982年第五屆國際運動生化會議，運動性疲勞是指，機體生理過程不能持續(xù)其機能在一特定水平或各器官不能維持預(yù)定的運動強度。在我國，40歲以上的白領(lǐng)階層中，75%屬于亞健康人群，40%主訴慢性疲勞[4]。因此，篩選具有抗疲勞或改善疲勞的保健食品/藥物，是當(dāng)今科學(xué)研究的一大熱點。目前，動物研究中常見的疲勞模型主要有跑臺[5]、游泳[6]、束縛[7]、睡眠剝奪(水平臺法)[8]等。本實驗室前期研究結(jié)果表明滾筒法睡眠干擾(sleep interruption，SI)可導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[9-10]和抑郁等腦力疲勞[11-12]。本實驗采用滾筒法對動物進行不同時間的睡眠干擾，研究造成小鼠體力疲勞的干擾強度，為體力疲勞慢性模型的建立和防護產(chǎn)品研發(fā)提供一種穩(wěn)定可靠的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

ICR雄性小鼠48只，SPF級，體重21～23 g，5～6周齡，來源于北京維通利華實驗動物公司[SCXK (京) 2016-0006]。實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動物實驗設(shè)施內(nèi)進行[SYXK (京) 2018-0020]，倫理委員會審批號：SLXD-201803170028，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學(xué)要求。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體重分為睡眠干擾5 d組、10 d組、15 d組和空白對照組，每組12只，自由飲食飲水。實驗室安靜，溫度24℃，12 h照明/12 h黑暗環(huán)境(8:00 a.m.開燈)。

1.2 主要試劑與儀器

血清尿素氮和肝糖原試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。大小鼠睡眠干擾儀、小鼠自主活動實時測試分析處理系統(tǒng)、小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀、小鼠負重游泳測試分析系統(tǒng)均由北京康森益友公司、儀康科技(北京)有限公司聯(lián)合研制；變溫紫外-可見分光光度儀(Agilent Cary100，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 睡眠干擾實驗

大小鼠睡眠干擾儀由滾筒和控制機箱兩部分組成。自行設(shè)定控制參數(shù)，使干擾儀以不同模式轉(zhuǎn)動對滾筒內(nèi)飼養(yǎng)動物進行不同時長睡眠干擾。睡眠干擾組：先將睡眠干擾15 d組放入滾筒內(nèi)，5 d后將睡眠干擾10 d組放入滾筒內(nèi)，10 d后將睡眠干擾5 d組放入。滾筒直徑40 cm、長22 cm，每個滾筒放一組動物(12只)，滾動參數(shù)為：3 r/min，每轉(zhuǎn)1 min，間隔1 min；在干擾造模時間點取出測試組進行行為學(xué)檢測，測試完畢后繼續(xù)放入滾筒進行睡眠干擾，直至行為學(xué)檢測完全結(jié)束。對照組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2 轉(zhuǎn)輪實驗

于滾筒法睡眠干擾第16天，采用轉(zhuǎn)輪式疲勞儀進行測試，條件：轉(zhuǎn)速25 r/min、刺激電流0.2 mA[13]。轉(zhuǎn)輪底端有刺激電流，為避免電擊，小鼠必須保持跑動狀態(tài)。當(dāng)小鼠力竭時，會跟不上轉(zhuǎn)輪速度，滑到轉(zhuǎn)輪底端，小鼠身體觸碰到整個電路造成短路，轉(zhuǎn)輪停止轉(zhuǎn)動，儀器自動記錄力竭時間。

1.3.3 負重游泳實驗

于滾筒法睡眠干擾第17天將小鼠置于獨立自動檢測的游泳箱中游泳，水溫(25 ± 0.5)℃[14]，鼠尾根部負荷10%體重的鉛皮[15]，水深≥ 25 cm。自動記錄小鼠自游泳開始至力竭時間段內(nèi)的行為。力竭時間從小鼠頭部沉入水中，經(jīng)7 s仍不能返回水面為止。游泳結(jié)束后，立即撈出小鼠，擦干小鼠身上的水分，放回原來的籠中。

1.3.4 生化指標的測定

于負重游泳實驗前半個小時對各組小鼠禁食，負重游泳實驗結(jié)束半小時后，取血，4℃靜置4 h，低溫離心后，分取血清。小鼠脫臼處死，取肝組織以冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，于-80℃貯藏。血清尿素氮和肝糖原的含量按試劑盒說明書測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同睡眠干擾時間對小鼠體重的影響

圖1顯示，經(jīng)過5, 10, 15 d睡眠干擾后，與對照組比較，睡眠干擾組體重均明顯降低(P< 0.05)。

注：SI，睡眠干擾；下圖同。小鼠每5 d稱重一次。各干擾組與對照組比較，*P < 0.05。圖1 不同睡眠干擾時間對小鼠體重的影響Note. SI, sleep interruption; the same in the following figures. Mice were weighed every 5 days. SI groups compared with the control group, * P < 0.05.Figure 1 Effect of different sleep interruption time on the body weight of mice

2.2 不同睡眠干擾時間對小鼠轉(zhuǎn)輪力竭時間的影響

由圖2可見，各睡眠干擾組與對照組比較，轉(zhuǎn)輪力竭時間差異無顯著性(P> 0.05)，但呈現(xiàn)出干擾時間越長，小鼠力竭時間減少的趨勢。

注：A：對照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。圖2 不同睡眠干擾時間對小鼠轉(zhuǎn)輪力竭時間的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group.Figure 2 Effects of different sleep interruption times on the rotating wheel exhausted test time

2.3 不同睡眠干擾時間對小鼠負重游泳力竭時間的影響

游泳實驗結(jié)果如表1所示。表1中，睡眠干擾10 d、15 d組與空白對照組比較，負重游泳力竭時間明顯縮短(P< 0.05，P< 0.01)；睡眠干擾5 d組與對照組差異無顯著性(P> 0.05)。下沉次數(shù)和下沉總時間反映了小鼠在負重游泳過程中的耐力，耐力程度與下沉次數(shù)和下沉總時間成正比。睡眠干擾10 d、15 d組與正常對照組比較，下沉次數(shù)和下沉總時間顯著減少(P< 0.01)；睡眠干擾5 d組與對照組差異無顯著性(P> 0.05)。

表1 不同睡眠干擾時間對小鼠負重游泳的影響Table 1 Effect of different sleep interruption times on loaded swimming

注：SI，睡眠干擾。與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. SI, sleep interruption. SI groups compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.4 慢性疲勞模型對小鼠血清尿素氮的影響

如圖3所示，睡眠干擾10 d和15 d組的血清尿素氮含量較空白對照組顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)。而干擾5 d組僅有上升趨勢，差異無顯著性。

注：A：對照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖3 不同睡眠干擾時間對小鼠血清尿素氮的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group.SI groups compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 3 Effects of different sleep interruption times on serum urea nitrogen in the mice

2.5 慢性疲勞模型對小鼠肝糖原的影響

如圖4所示，睡眠干擾5 d和10 d組的肝糖原含量較空白對照組顯著降低(P< 0.01)，睡眠干擾15 d組的肝糖原含量較空白對照組顯著降低(P< 0.05)。

注：A：對照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖4 不同睡眠干擾時間對小鼠肝糖原的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group. SI groups compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 4 Effects of different sleep interruption times on hepatic glycogen in the mice

3 討論

負重游泳時間的長短可以直接反映動物運動疲勞的程度，本實驗采用自主研發(fā)的小鼠負重游泳實驗系統(tǒng)，能采集除力竭時間外的其他評價小鼠耐力的指標[14]。負重游泳力竭實驗中，睡眠干擾10 d、15 d組與空白對照組比較，首次下沉?xí)r間和首次連續(xù)下沉?xí)r間明顯縮短，但是差異無顯著性，主要是由于小鼠間存在個體差異；負重游泳力竭時間、下沉次數(shù)、下沉總時間等耐力性指標顯著縮短，這說明睡眠干擾10, 15 d均可造成小鼠運動耐力顯著下降。轉(zhuǎn)輪實驗中各睡眠干擾組與對照組比，呈現(xiàn)出干擾時間越長，小鼠力竭時間越短的趨勢，但是差異無顯著性。推測本模型造模原理與轉(zhuǎn)輪相似，因此在轉(zhuǎn)輪評價小鼠耐力上不敏感。

糖原的含量能說明疲勞發(fā)生的快慢或程度。肌糖原消耗的同時，為維持血糖水平，肝糖原儲備量減少[16]。尿素氮含量是蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的重要產(chǎn)物之一，運動負荷增加，機體能量代謝平衡被破壞時，蛋白質(zhì)分解供能，血中尿素氮的含量增加。其與機體機能、疲勞程度呈正相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示睡眠干擾各組與空白對照組比較，睡眠干擾各組肝糖原含量均出現(xiàn)顯著降低；睡眠干擾10 d、15 d組較空白對照組的血清尿素氮含量顯著升高。說明由于游泳力竭，小鼠機體代謝糖供應(yīng)不足，蛋白質(zhì)開始分解供能。睡眠干擾5 d組僅造成了肝糖原與對照組相比降低，負重游泳和血清尿素氮檢測結(jié)果均為陰性，說明睡眠干擾5 d不能造成小鼠的體力疲勞。

綜合上述行為學(xué)和生化指標檢測結(jié)果，ICR小鼠在滾筒式睡眠干擾所致慢性疲勞的行為學(xué)表現(xiàn)中，干擾10 d和15 d均可致小鼠表現(xiàn)出體力疲勞行為，進一步完善后，將為睡眠障礙所致慢性疲勞的發(fā)病機制、篩選改善睡眠運動障礙所致體力疲勞藥物和保健品的研發(fā)提供一種穩(wěn)定可靠的動物模型。