李玉梅，鮑慧瑋，王楚盈*，張亞杰，韓 冬，潘建衡，方 晶，黃金秋，劉仲康

(1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2. 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院麥克德?tīng)柮椎聦?shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130012)

近年來(lái)，提出血管新生的概念，血管新生是機(jī)體正常發(fā)育和組織修復(fù)的基礎(chǔ)，是一系列復(fù)雜的生物學(xué)行為。缺血性心臟病、糖尿病所致的傷口不易愈合等，其根本原因均與血管新生功能不良有關(guān)[1-2]。治療性血管新生則是使機(jī)體在缺血或缺氧等狀態(tài)下，通過(guò)修復(fù)以及重塑或是促進(jìn)新生血管，改善缺血缺氧等病理狀態(tài)。而在治療性血管新生過(guò)程中，最關(guān)鍵環(huán)節(jié)則是內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化。

中醫(yī)藥在治療性血管新生方面歷史悠久，中醫(yī)認(rèn)為祛瘀血可以生新絡(luò)，益氣、活血、化瘀等藥物均對(duì)血管新生具有一定療效，如黃芪為傳統(tǒng)的補(bǔ)氣藥，黃芪中的黃芪甲苷可以促進(jìn)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，有利于血管生成[3-4]。當(dāng)歸為補(bǔ)血藥，當(dāng)歸中的阿魏酸則具有抑制血小板聚集，輔助建立側(cè)枝循環(huán)，改善缺血區(qū)供血，促進(jìn)血管再生。然而二成分合用如何促進(jìn)新生血管，機(jī)制尚不完全明確，因此本實(shí)驗(yàn)采用氯化鈷建立HUVECs缺氧損傷模型，探索黃芪甲苷與阿魏酸合用對(duì)血管生成影響的潛在機(jī)制，為臨床治療與血管新生相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(上海澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要試劑與儀器

阿魏酸(純度> 98%，批號(hào)：GR-134-170925，南京廣潤(rùn)生物制品有限公司)；黃芪甲苷(純度> 98%，批號(hào)：150202，成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司)；HUVECs完全培養(yǎng)液(批號(hào)：170521，澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司)；HUVECs基礎(chǔ)培養(yǎng)基(批號(hào)：170525，澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶(批號(hào)：42H10121，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CCK-8(上海翊圣生物科技有限公司)；BD MatrigelTMBasement Membrane Matirx基質(zhì)膜(批號(hào)：7345017，Corning Incorporated)；AG490(批號(hào)：X15A7Y19393，上海源葉生物科技有限公司)。SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；YLD-6000恒溫震蕩培養(yǎng)箱(江蘇金壇市億通電子有限公司)；XI5300熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)；酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；TDL-80-2B低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；WD-9405B水平搖床(北京六一)；DYY-7C電泳儀(北京六一)；DYCZ-40D轉(zhuǎn)移槽(北京六一)；DYCZ-24DN北京雙垂直蛋白電泳儀(北京六一)；WD-9413B凝膠成像系統(tǒng)(北京六一)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及給藥處理

HUVECs接種于96孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液各給藥組進(jìn)行如下操作：①正常對(duì)照組：給予等體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；②模型對(duì)照組：給予氯化鈷250 μmol/L；③黃芪甲苷組，給予終濃度為250 μmol/L氯化鈷及50 μmol/L的黃芪甲苷；④阿魏酸組，給予終濃度為250 μmol/L氯化鈷及100 μmol/L的阿魏酸；⑤黃芪甲苷+阿魏酸合用組：給予終濃度為250 μmol/L氯化鈷、50 μmol/L的黃芪甲苷及100 μmol/L的阿魏酸。⑥AG490組：給予100 μmol/L AG490；⑦黃芪甲苷+阿魏酸組+ AG490組：給予終濃度為100 μmol/L AG490、50 μmol/L的黃芪甲苷及100 μmol/L的阿魏酸，上述各組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 內(nèi)皮細(xì)胞增殖檢測(cè)

藥物干預(yù)結(jié)束后采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔中重新加入100 μL內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基及10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，采用酶標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm測(cè)定各組細(xì)胞吸光度值。采用死活細(xì)胞染色技術(shù)，觀察死活細(xì)胞情況，將鈣黃素及碘化丙啶(PI)染色液加依次加到細(xì)胞孔中，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置5 min。吸棄染色液，在熒光倒置顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為綠色，死細(xì)胞為紅色，拍照記錄。

細(xì)胞存活率(%)=各組吸光度值/正常對(duì)照組吸光度值×100%。

1.3.3 熒光染色觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)

HUVECs按1.3.1方法處理后使用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，每孔加入100 μL羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(TRITC phalloidin)工作液，室溫避光孵育30 min，用PBS清洗3次，100 μL DAPI溶液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，約30 s，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

接種細(xì)胞前先用標(biāo)記筆在24孔板各孔底部劃井字線，調(diào)整細(xì)胞濃度并接種于24孔板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔底部，吸棄培養(yǎng)液，用1 mL移液槍頭沿中軸劃一道劃痕，用PBS清洗細(xì)胞表面2次除去漂浮的細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行劃痕部位拍攝，拍攝后按1.3.1方法給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在同一位置再次拍照，用Image J圖像處理軟件測(cè)量遷移距離，與自身劃痕距離作對(duì)比，計(jì)算遷移率，判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)能力。

1.3.5 內(nèi)皮細(xì)胞體外成管實(shí)驗(yàn)[5]

基質(zhì)膠至于4℃冰箱，冰浴過(guò)夜進(jìn)行解凍。將基質(zhì)膠鋪于96孔板中每孔50 μL，放置于培養(yǎng)箱30 min使其凝固。將細(xì)胞用含藥培養(yǎng)基配置成細(xì)胞懸液，接種于基質(zhì)膠上，每孔50 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，于倒置顯微鏡下觀察微管形成情況，選取6個(gè)不同視野，記錄平均節(jié)點(diǎn)數(shù)。

1.3.6 Western blot檢測(cè)p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)

將HUVECs調(diào)整濃度至每孔1 × 105個(gè)，置于6孔板中，按照1.3.1中方法進(jìn)行處理，給藥培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入蛋白裂解液，冰上靜置5 min，低溫冷凍離心，12 000 r/min 4℃離心10 min。分離上清為所得的蛋白質(zhì)抽提物，用5× loading buffer和PBS稀釋蛋白樣品，于沸水浴中煮沸5 min。行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，用TBST緩沖液配制5%(質(zhì)量/體積)脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗分別為p-JAK2抗體、p-STAT3抗體，孵育二抗為羊抗兔IgG，TBST漂洗后進(jìn)行ECL底物發(fā)光。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 黃芪甲苷與阿魏酸合用對(duì)氯化鈷損傷的HUVECs增殖的影響結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)氯化鈷處理后的HUVECs的存活率(模型組)明顯低于對(duì)照組(P< 0.05)。阿魏酸、黃芪甲苷干預(yù)后細(xì)胞存活率有所增加。二藥合用與單獨(dú)給藥相比，細(xì)胞存活率顯著增加(P< 0.001)。給予AG490通路抑制劑后，明顯抑制細(xì)胞增殖，給予阿魏酸、黃芪甲苷兩藥后，與AG490組比較，細(xì)胞明顯增多。兩藥合用具有明顯的拮抗AG490對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用(表1)。死活細(xì)胞染色結(jié)果與酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果一致(圖1)。

表1 藥物對(duì)HUVECs細(xì)胞活力的影響Table 1 Effects of drugs on the viability of HUVECs

注：與對(duì)照組比較，▲P< 0.05；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與AG490組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。
Note. Compared with the control group, ▲P< 0.05. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the AG490 group,#P< 0.05,##P< 0.01.

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。紅色為死細(xì)胞；綠色為活細(xì)胞。圖1 死活細(xì)胞染色結(jié)果(× 100)Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV. Red indicates dead cells; Green indicates living cells.Figure 1 Staining results of living and dead cells

2.2 阿魏酸與黃芪甲苷合用對(duì)缺氧損傷HUVECs形態(tài)的影響結(jié)果

由熒光染色結(jié)果顯示(圖2)，氯化鈷刺激后，對(duì)細(xì)胞造成損傷，細(xì)胞狹長(zhǎng)，出現(xiàn)皺縮，骨架縮小等，有些細(xì)胞甚至未見(jiàn)明顯的細(xì)胞骨架(見(jiàn)模型組)。對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好。給予黃芪甲苷、阿魏酸之后，細(xì)胞形態(tài)有所改善，細(xì)胞扁平，成多角形，有偽足，纖維蛋白絲清晰可見(jiàn)。給予AG490后，細(xì)胞也出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較明顯減少，給予黃芪甲苷及阿魏酸后，細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均有所改善。黃芪甲苷與阿魏酸具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，改善細(xì)胞形態(tài)的作用，聯(lián)合使用，效果更佳。

2.3 阿魏酸與黃芪甲苷合用對(duì)缺氧損傷HUVECs遷移能力的作用結(jié)果

與自身劃痕距離做對(duì)比進(jìn)行計(jì)算遷移率，結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞遷移率為49.52%，模型組由于氯化鈷造成缺氧損傷，細(xì)胞的遷移能力下降，細(xì)胞修復(fù)至中央劃痕區(qū)的遷移率僅為12.98%。經(jīng)黃芪甲苷及阿魏酸干預(yù)后，細(xì)胞的劃痕修復(fù)距離有所增加，黃芪甲苷、阿魏酸、黃芪甲苷+阿魏酸合用組均為100%，劃痕區(qū)域均長(zhǎng)滿細(xì)胞。給予AG490后，細(xì)胞遷移距離為13.45%，同時(shí)給予黃芪甲苷和阿魏酸，間隙縮小，遷移距離為52.12%。黃芪甲苷與阿魏可促進(jìn)缺氧HUVECs的遷移運(yùn)動(dòng)(結(jié)果見(jiàn)表2，圖3)。

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。紅色為纖維蛋白絲；藍(lán)色為細(xì)胞核。圖2 各給藥組對(duì)HUVEC細(xì)胞形態(tài)的影響(× 100)Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV. Red indicates fibrin filament; Blue indicates nucleus.Figure 2 Protective effect of the drugs on endothelial cells in each group

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。標(biāo)尺=50 μm。圖3 藥物對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移測(cè)定的影響(× 40)Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV.Bars=50 μm.Figure 3 Effects of the drugs on HUVEC migration

2.4 阿魏酸與黃芪甲苷合用體外成管作用的結(jié)果

如圖4所示，所有組的HUVECs在24 h后形成了毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比，黃芪甲苷、阿魏酸以及兩藥合用成管能力均有所增加，尤以兩藥合用效果較好，管的長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)均可見(jiàn)明顯增加(表3)。給予AG490后成管能力與對(duì)照組比較明顯降低，同時(shí)給予黃芪甲苷及阿魏酸后，成管能力增加?？梢?jiàn)，兩藥合用，有利于體外血管生成。

2.5 p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，模型組給予氯化鈷后，由于造成缺氧損傷，激活JAK-STAT信號(hào)通路，p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)有所增加，黃芪甲苷、阿魏酸處理后，p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)進(jìn)一步增加。AG490抑制JAK信號(hào)通路，因此給藥后，p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)降低，阿魏酸及黃芪甲苷，可明顯拮抗AG490對(duì)p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)的抑制情況，給藥后p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)明顯增加(結(jié)果見(jiàn)圖5，圖6)。

表2 藥物對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移測(cè)定的影響Table 2 Effects of the drugs on HUVEC migration

注：與對(duì)照組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與AG490組比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001。
Note. Compared with the control group, ▲P< 0.05, ▲▲P< 0.01. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the AG490 group,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001.

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。圖4 體外成管情況(× 40)Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV.Figure 4 Angiogenesis in vitro

表3 藥物對(duì)HUVEC細(xì)胞體外成管作用結(jié)果Table 3 Effects of the drugs on HUVEC angiogenesis in vitro

注：與對(duì)照組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與AG490組比較，#P< 0.05。
Note. Compared with the control group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the AG490 group,#P< 0.05.

注：1：對(duì)照組；2：模型組；3：黃芪甲苷+阿魏酸組；4：阿魏酸組；5：黃芪甲苷組；6：黃芪甲苷+阿魏酸+ AG490組；7：AG490組。圖5 阿魏酸與黃芪甲苷合用對(duì)缺氧損傷HUVEC細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響Note. 1: Control group; 2: Model group; 3: Astragaloside IV + ferulic acid group; 4: Ferulic acid group; 5: Astragaloside IV group; 6: Astragaloside IV + ferulic acid + AG490 group; 7: AG490 group.Figure 5 Effect of astragaloside IV combined with ferulic acid on the p-JAK2 and p-STAT3 protein expression in HUVECs

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。與對(duì)照組比較，▲ P< 0.05，▲▲ P< 0.01，▲▲▲ P< 0.001；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與AG490組比較，# P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001。圖6 阿魏酸與黃芪甲苷合用對(duì)缺氧損傷HUVEC細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3蛋白灰度分析結(jié)果Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV. Compared with the control group, ▲ P< 0.05, ▲▲ P< 0.01, ▲▲▲ P< 0.001. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the AG490 group,# P < 0.05,## P < 0.01,### P < 0.001.Figure 6 Effect of astragaloside IV combined with ferulic acid on p-JAK2 and p-STAT3 protein expression levels in the HUVECs

3 討論

血管新生的概念早在《內(nèi)經(jīng)》中就有所記載，即：“生新祛瘀”。生新祛瘀是機(jī)體的正常生理功能，相當(dāng)于血液系統(tǒng)的新陳代謝，也可理解為新的血管的再生，即在已有的血管床上，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)芽長(zhǎng)出新支，形成血管網(wǎng)。血管生成不僅與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有關(guān)，還與血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔的形成密切相關(guān)[6]。阿魏酸是中藥當(dāng)歸的主要活性物質(zhì)，廣泛的存在于植物中的一種酚酸成分，現(xiàn)代藥理作用研究表明其具有明顯的抗血栓、抗氧化等功能[7-9]。無(wú)論在常氧或是缺氧狀態(tài)下，阿魏酸均能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，其對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能可能與ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)VEGF、HIF-1α基因等的表達(dá)有關(guān)[10-11]。黃芪甲苷是黃芪的主要藥效物質(zhì)，具有顯著的促受損心肌組織血管新生以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[3-4, 12]。聯(lián)合使用兩藥，可以作用于疾病網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)各靶點(diǎn)的作用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，達(dá)到最佳的治療效果。為了探究?jī)伤幒嫌?，調(diào)控血管新生作用的協(xié)同機(jī)制，我們建立了氯化鈷所致的內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型，研究?jī)伤幒嫌脤?duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選確定黃芪甲苷與阿魏酸的給藥劑量，采用氯化鈷致內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型，考察黃芪甲苷與阿魏酸合用對(duì)缺氧損傷細(xì)胞的保護(hù)作用以及促進(jìn)血管生成的作用，CCK-8檢測(cè)與死活細(xì)胞染色結(jié)果表明，阿魏酸組、黃芪甲苷組以及合用組均能提高細(xì)胞存活率，兩藥均可保護(hù)受損細(xì)胞，使細(xì)胞形態(tài)保持完整，尤以黃芪甲苷與阿魏酸聯(lián)合作用最強(qiáng)具有協(xié)同作用。體外成管及遷移實(shí)驗(yàn)中可看出，黃芪甲苷、阿魏酸均有明顯的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移以及成管的能力。

JAK-STAT信號(hào)通路是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，廣泛調(diào)節(jié)多種疾病的生理過(guò)程以及病理過(guò)程，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等許多重要的生物學(xué)過(guò)程[13]。JAK2-STAT3信號(hào)通路與血管新生作用關(guān)系密切，參與了血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)作用[14-15]。JAK2-STAT3激活后，STAT3磷酸化明顯增加，明顯上調(diào)HIF-1α和VEGF，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的迂移和血管的形成，有利于血管新生[16-20]。本研究采用Western blot法，從蛋白水平上檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示給予JAK2抑制劑AG490后，p-JAK2、p-STAT3較正常血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)明顯減少，黃芪甲苷與阿魏酸聯(lián)合給藥能顯著誘導(dǎo)JAK2磷酸化表達(dá)增加，STAT3磷酸化表達(dá)上調(diào)，明顯削弱了AG490對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的抑制作用?？梢?jiàn)，黃芪甲苷與阿魏酸聯(lián)合應(yīng)用具有促進(jìn)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管的能力，對(duì)缺氧細(xì)胞的形態(tài)起到保護(hù)作用，有利于血管生成，兩者促進(jìn)血管新生的機(jī)制可能與JAK2-STAT3信號(hào)通路有關(guān)。