馮顏，潘秋亞，項陽，李靜

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，中國醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001）

自身免疫性甲狀腺炎 （autoimmune thyroiditis，AIT） 是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的甲狀腺炎性疾病，主要以甲狀腺淋巴細胞浸潤和甲狀腺自身抗體陽性為特征，是多種免疫、遺傳和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果［1］。近年來的研究［2-4］表明，該病病理損傷并不只局限于甲狀腺，腎臟、大腦、肝臟等多組織器官均可受累。AIT病理損傷機制復(fù)雜，目前尚無確切定論。

蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶A3 （protein disulfide isomerase A3，PDIA3） 又名ERP57、 ER60、 GRP58和1，25D3-MARRS，廣泛存在于真核生物中，與鈣網(wǎng)蛋白 （calreticulin，CRT） 、鈣連接蛋白共同構(gòu)成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶復(fù)合物，介導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊與修飾［5］。PDIA3與多種自身免疫性疾病密切相關(guān)［6］，但目前尚無PDIA3與AIT的相關(guān)文獻報道。本研究擬探討血清PDIA3抗體 （anti-PDIA3 antibody，PDIA3Ab） 總IgG及其各亞型滴度與AIT之間的相互關(guān)系，為AIT及其相關(guān)疾病提供新的診斷、治療靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2013年5月至2015年3月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌門診及病房隨機選取同意參與調(diào)查的AIT患者36例作為AIT組，平均年齡 （46.31±15.74）歲，男3例，女33例，其中甲狀腺功能 （以下簡稱甲功）正常組20例，甲狀腺功能減退 （以下簡稱甲減） 組16例。另選取年齡與之相匹配的29例非AIT且甲功正常的患者作為對照組。平均年齡 （40.48±14.92） 歲，男7例，女22例。AIT診斷標準：外周血血清甲狀腺過氧化物酶抗體 （thyroid peroxidase antibody，TPOAb） 或甲狀腺球蛋白抗體 （thyroglobulin antibody，TgAb） 水平升高，甲狀腺彩超示彌漫性低回聲，可伴有網(wǎng)格狀改變或分布不均勻。2組均否認其他自身免疫性疾病史、惡性腫瘤史、心腦血管疾病史及近期感染史。

1.2 研究方法

1.2.1 測定PDIA3Ab總IgG及各亞型滴度：用pH9.6碳酸鹽緩沖液將PDIA3重組蛋白 （Abcam公司，英國）稀釋成10 ng/μL （1︰100） 包被酶標板，PDIA3Ab總IgG、IgG1對應(yīng)的血清稀釋倍數(shù)是1︰100，IgG2、IgG3、IgG4對應(yīng)的血清稀釋倍數(shù)為1︰50，分別以1︰10 000辣根過氧化物酶標記的羊抗人總IgG （Bioss公司，中國） 和鼠抗人IgG1、IgG2 、IgG3、IgG4 （Abcam公司，英國） 作為二抗。最后將3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺作為顯色液，用2 mol/L鹽酸終止實驗，在450 nm下讀取吸光度。

1.2.2 檢測甲功及TPOAb、TgAb：采用E601羅氏電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀測定血清促甲狀腺激素 （thyrotrophin，TSH） 、游離三碘甲狀腺原氨酸 （free triiodothyronine，F(xiàn)T3） 、游離甲狀腺素 （free thyroxine，F(xiàn)T4） 、TPOAb和TgAb水 平。TSH、FT3與FT4的 正 常參考范圍分別是0.27～4.2 mIU/L、3.1～6.8 pmol/L和12～22 pmol/L，TPOAb正常參考范圍是0～34 IU/L，TgAb正常參考范圍是0～115 IU/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分數(shù)表示，采用χ2檢驗和Fisher確切概率法比較組間差異，非正態(tài)分布計量資料的組間比較采用Mann WhitneyU檢驗。Spearman檢驗進行相關(guān)性分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AIT甲功正常組、AIT甲減組與非AIT組患者血清PDIA3Ab滴度比較

與非AIT組相比，AIT甲功正常組血清PDIA3Ab總IgG、IgG1和IgG3滴度均顯著升高 （P＜ 0.01） ，IgG2、IgG4滴度無明顯變化 （P＞ 0.05）；AIT甲減組血清PDIA3Ab總IgG、IgG1和IgG3滴度明顯升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜ 0.05） ，IgG2、IgG4滴度亦無明顯變化 （P＞ 0.05） ，見圖1、2。將對照組PDIA3Ab總IgG、IgG1、IgG3滴度值第97.5百分位數(shù)作為各自對應(yīng)的陽性臨界值 （分別是0.46、0.27、0.19） ，AIT甲功正常組和AIT甲減組PDIA3Ab總IgG陽性率分別為95.0%、100%；PDIA3IgG1陽 性 率 分 別 為70.0%、93.75%，PDIA3AbIgG3陽性率分別為75.0%、62.5%，2組間均無統(tǒng)計學(xué)差異 （Fisher確切概率法P＞ 0.05） 。

圖1 AIT患者血清PDIA3Ab總IgG滴度分析Fig.1 Levels of PDIA3Ab total serum IgG in patients with AIT

圖2 AIT患者血清PDIA3Ab各亞型滴度分析Fig.2 Levels of IgG subclasses of PDIA3Ab in sera from patients with AIT

2.2 AIT甲功正常組、AIT甲減組血清PDIA3Ab滴度比較

AIT甲功正常組與AIT甲減組血清PDIA3Ab總IgG及各亞型滴度比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05） ，見圖3。

圖3 AIT甲功正常組、AIT甲減組血清PDIA3Ab的表達比較Fig.3 The expression of PDIA3Ab total serum IgG and IgG subclasses in AIT with euthyroidism and hypothyroidism group

2.3 AIT患者血清PDIA3Ab與甲功、TPOAb、TgAb的相關(guān)性

AIT甲減組血清PDIA3Ab IgG1亞型滴度與TgAb呈負相關(guān) （r= -0.679，P＜ 0.01） ，與TPOAb、TSH、FT3、FT4均無關(guān) （P＞ 0.05） ，排除TPOAb、TgAb影響后，PDIA3AbIgG1亞型滴度與TSH呈正相關(guān) （r= 0.550，P＜ 0.05） ，與FT3、FT4無明顯相關(guān) （P＞ 0.05） 。AIT甲功正常組、AIT甲減組血清PDIA3Ab總IgG、IgG3與TPOAb、TgAb、TSH、FT3、FT4無顯著相關(guān) （P＞ 0.05） 。見表1。

3 討論

PDIA3是PDI家族成員之一，是一種多功能蛋白分子伴侶。它能夠催化二硫鍵的形成、還原與異構(gòu)，有助于蛋白質(zhì)的合成與折疊。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，大量異常結(jié)構(gòu)蛋白蓄積，可繼發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，此時PDIA3水平明顯升高［7］。PDIA3水平上調(diào)出現(xiàn)于多種疾病中，在胎膜早破、腸易激綜合征、肝細胞性肝癌［8-10］中均有報道。既往研究表明PDIA3Ab在多種自身免疫性疾病中呈高表達。肝腎微粒體抗體1是2型自身免疫性肝炎的診斷學(xué)標志物，而LKM-1陽性血清亦能識別PDIA3［11］。等［12］研究發(fā)現(xiàn)PDIA3是慢性風(fēng)濕性心臟病患者外周血T細胞和心臟浸潤T細胞的靶抗原。ZHENG等［13］則認為PDIA3可能是牛膝總皂苷治療滑膜型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生物學(xué)標志。

表1 AIT患者血清PDIA3Ab與甲功、TPOAb、TgAb的相關(guān)性分析 （r）Tab.1 The association of aPDIA3Ab total serum IgG and its subclasses with thyroid function，TPOAb and TgAb in patients with AIT （r）

本研究首次探討了PDIA3Ab與AIT之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AIT患者血清PDIA3Ab總IgG、IgG1、IgG3滴度均顯著高于非AIT患者，PDIA3Ab總IgG、IgG3滴度均與甲功無關(guān)，IgG1亞型滴度與TSH呈正相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)僅為0.55，且與FT3、FT4無關(guān)。說明PDIA3并不是造成甲功異常的致病抗原，可能與AIT相關(guān)病理損傷有關(guān)。

PDIA3主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，免疫刺激可驅(qū)使其向細胞膜表面移動，介導(dǎo)PDIA3自身免疫性抗體產(chǎn)生，PDIA3Ab可抑制T細胞活化，與干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ） 、白細胞介素4 （interleukin-4，IL-4） 、白細胞介素17 （interleukin-17，IL-17） 共同調(diào)控CD4+T細 胞［14］。CAORSI等［15］研 究 發(fā) 現(xiàn)，血 清PDIA3Ab高表達的結(jié)腸癌患者生存率顯著高于血清PDIA3Ab陰性患者，且腫瘤浸潤T細胞中輔助性T細胞1 （helper T cell-1，Th-1） 、輔助性T細胞17 （helper T cell-17，Th-17） 細胞比例明顯增加。有研究［16］發(fā)現(xiàn)發(fā)病的狼瘡動物模型小鼠血清PDIA3Ab滴度顯著高于未發(fā)病組。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AIT患者血清PDIA3IgG1亞型滴度與TgAb呈負相關(guān)，提示PDIA3Ab確實能夠抑制CD4+T細胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，阻止甲狀腺濾泡細胞破壞。另外，PDIA3是一種高度保守的分子伴侶蛋白，甲狀腺炎癥反應(yīng)時濾泡細胞結(jié)構(gòu)破壞，PDIA3釋放，能夠誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)和PDIA3Ab產(chǎn)生。CHIGNARD等［17］研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞性肝癌患者外周血PDIA3裂解片段與正常人、慢性肝炎患者相比表達明顯增加。因此，PDIA3胞外分泌量可能與局部組織病理損傷、凋亡程度密切相關(guān)。腫瘤細胞凋亡早期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的CRT、PDIA3可從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細胞膜表面，細胞膜分子構(gòu)成改變，免疫原性增強，CRT、PDIA3可作為自身抗原誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答，產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)［18］。既往研究表明Bax、Bak、caspase-8等凋亡因子可增強PDIA3轉(zhuǎn)位效應(yīng)［19］，介導(dǎo)免疫原性死亡，而Bcl-2、Bax在AIT患者甲狀腺濾泡細胞上高表達［20］，可能通過促進甲狀腺濾泡細胞內(nèi)PDIA3向細胞膜趨化增強免疫應(yīng)答。但凋亡因子促進PDIA3轉(zhuǎn)位效應(yīng)僅在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，是否對自身免疫性炎癥細胞也存在此效應(yīng)尚需進一步研究。

人體內(nèi)IgG亞型含量IgG1＞IgG2＞IgG3＞IgG4，IgG1、IgG3激活補體和致抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)作用最強，IgG2主要參與多糖抗原的應(yīng)答，IgG4生物活性最低［21-22］。本研究中，AIT組血清PDIA3Ab總IgG、IgG1、IgG3表達增加，AIT甲功正常組、AIT甲減組血清PDIA3Ab及各亞型表達無顯著差異。一方面，PDIA3Ab滴度升高可能拮抗T細胞活化［16］，另一方面，PDIA3參與主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類分子的組裝及抗原提呈過程，有助于激活CD8+T細胞發(fā)揮細胞毒效應(yīng)［23］。PDIA3Ab及其亞型可通過補體、體液免疫途徑損傷PDIA3表達的靶細胞，但該抗體不是破壞甲狀腺的主要抗體，故推測PDIA3Ab可能主要作用于AIT的腺外損害。PDIA3與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。腦組織內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積是阿爾茲海默癥發(fā)病的主要機制之一，正常情況下β淀粉樣蛋白與PDIA3、CRT構(gòu)成復(fù)合體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被加工，阿爾茲海默癥患者PDIA3水平減低，β淀粉樣蛋白不能被正確處理而聚集。薯蕷皂甙元是PDIA3的外源性激活劑，可改善阿爾茲海默癥病理損傷［24-25］。腦組織低水平PDIA3還可能與癲癇自發(fā)性發(fā)作密切相關(guān)［26］。筆者推測PDIA3Ab可能在AIT相關(guān)大腦損害中發(fā)揮重要作用，但并不一定是PDIA3Ab單一作用所致，還需要進一步研究加以佐證。

綜上所述，PDIA3可能是AIT發(fā)病過程中的一種非經(jīng)典抗原，其抗體高表達與甲狀腺腺外損害有關(guān)，檢測PDIA3Ab及其亞型水平可能成為AIT患者系統(tǒng)綜合診治的新靶點。但本研究樣本量較少，缺少PDIA3與AIT相關(guān)腦病的人體或動物模型研究，還需要更大樣本量、更深入的研究進行確證。