李巖，張德巍，楊大業(yè)

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院第三普通外科，沈陽 110032）

肺癌是發(fā)病率和死亡率均高的惡性腫瘤，我國由于人口老齡化加劇、環(huán)境惡化以及人們不良生活習(xí)慣增加，肺癌發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢［1-2］。目前肺癌治療仍然存在著治愈率低、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等缺點，需要尋找可以延長患者生存期，同時減輕化療藥物不良反應(yīng)的治療方法。

那可丁是來自罌粟屬植物鴉片中的一種異喹啉類生物堿，近幾十年一直用作鎮(zhèn)咳藥，其代謝物歸屬、生物利用度和藥物動力學(xué)都已得到了較深入的研究。近年來，那可丁及其衍生物的抗腫瘤作用得到了廣泛而系統(tǒng)研究［3］，它們具有抗腫瘤活性高、作用機制獨特、不良反應(yīng)小等特點。體外增殖實驗［4-5］結(jié)果表明，不同腫瘤細(xì)胞株對那可丁的敏感性不同，IC50值為10～50 μ mol/L，對于一些耐藥腫瘤細(xì)胞也有明顯的療效。那可丁同樣具有體內(nèi)抗腫瘤活性，且對多種腫瘤細(xì)胞有效［6］。本研究以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為研究對象，探討那可丁對A549細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，以期待尋找更好可以作為治療肺癌的潛在化療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 （實驗室凍存） ，DMEM培養(yǎng)基 （美國Hyclone公司） ，胎牛血清 （杭州四季青公司） ，那可丁 （江蘇豪森公司） ，四甲基偶氮唑藍(lán) （北京中杉金橋公司），DMSO （美國Sigma公司） ，Hoechst 33258、臺盼藍(lán) （上海碧云天公司） ，Cyclin D1、BCL-2、MMP2和GAPDH抗體 （美國Santa公司） ，實驗所需二抗購于北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將A549細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實驗：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化傳代，以1×104/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積200 μ L，貼壁后分別使用NaCl （對照組） 及10 μ mol/L與20 μ mol/L那可丁分別處理細(xì)胞。處理后的細(xì)胞于0 、12 、24、36、48、60 h （3個副孔） 分別加入5 mg/mL MTT溶液 （10 μ L） ，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔中加入200 μ L DMSO，震蕩10 min后在490 nm處記錄吸光值。

1.2.3 Hoechst 33258染色：將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成1×106/mL濃度的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，加入不同處理因素。藥物作用24 h后，每孔加入100 μ L Hoechst 33258孵育染色15 min，PBS洗凈后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Transwell實驗：對數(shù)生長期細(xì)胞以1×105/mL濃度接種于上室中，終體積200 μ L，下室加入600 μ L雙無培養(yǎng)基，加入不同處理因素，各組均設(shè)3個副孔。24 h后取出小室，擦去上層細(xì)胞，PBS清洗后95%乙醇固定20 min，4%臺盼藍(lán)染色20 min。200倍顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blotting檢測：不同濃度藥物處理細(xì)胞24 h后，使用RIPA裂解液搜集并裂解細(xì)胞，提取蛋白，定量后取30 μ g蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜 （4 ℃，100 V，1 h） 后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗4 ℃過夜后TBST清洗3次。二抗室溫1 h后TBST清洗3次。

1.2.6 實時PCR檢測：trizol裂解細(xì)胞后通過氯仿抽提，異丙醇沉淀，乙醇洗滌后獲取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。所用引物：Cyclin D1，正向5’-CCAACCTCCTCAACGACC-3’，反向5’-CACAGAGGGCAACGAAG-3’；BCL-2，正向5’-GGTGA ACTGGGGGAGGATTG-3’，反向5’-GGCAGGCATGT TGACTTCAC-3’；MMP2，正向5’-CGCATCTGGGGC TTTAAACAT-3’，反向5’-TCAGCACAAACAGGTTGC AG-3’；GAPDH，正向5’-GGCAAATTCAACGGCAC AGT-3’，反向5’-TAGGGCCTCTCTTGCTCAGT-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用非配對t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 那可丁對A549細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，那可丁對A549細(xì)胞作用0 、12、24、36、48、60 h后可以顯著抑制A549細(xì)胞增殖，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （均P＜ 0.05） ，那可丁對細(xì)胞增殖抑制作用隨著濃度增加而增加，10 μ mol/L與20 μ mol/L那可丁對A549細(xì)胞抑制率比較有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜ 0.05） 。見表1。

MTT實驗發(fā)現(xiàn)那可丁可以顯著抑制A549細(xì)胞增殖，本研究檢測那可丁對調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白——Cyclin D1的作用，結(jié)果顯示，對照組，那可丁10 μ mol/L組、20 μ mol/L組Cyclin D1mRNA表達(dá)分別為1.34±0.04、 0.55±0.17、0.36±0.03。不同濃度那可丁對Cyclin D1蛋白及mRNA均有一定程度抑制作用，并且隨著藥物濃度的升高抑制作用增強。見圖1。

表1 不同劑量的那可丁對A549細(xì)胞增殖的抑制率 （%）Tab.1 The rate of inhibition of A549 cell proliferation for different doses of noscapine （%）

2.2 那可丁對A549細(xì)胞凋亡的影響

圖1 那可丁對A549細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)的影響Fig.1 Cyclin D1 expression in A549 cells treated with different concentrations of noscapine

通過Hoechst 33258染色檢測那可丁對A549細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，那可丁可以促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度的增加凋亡細(xì)胞明顯增加。見圖2。

BCL-2蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要蛋白，本研究檢測那可丁對BCL-2的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，對照組，那可丁10 μ mol/L組、20 μ mol/L組BCL-2 mRNA表達(dá)分別為1.19±0.03、 0.59±0.11、0.41±0.03。不同濃度那可丁對BCL-2mRNA及蛋白表達(dá)均有一定程度的抑制作用，并且隨著藥物濃度升高抑制作用增強。見圖3。

圖2 不同濃度那可丁作用下A549細(xì)胞凋亡比較 ×200Fig.2 Apoptosis of A549 cells treated with different concentrations of noscapine ×200

圖3 不同濃度那可丁作用下A549細(xì)胞中BCL-2表達(dá)比較Fig.3 BCL-2 expression in A549 cells treated with different concentrations of noscapine

2.3 那可丁對A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組，那可丁10 μ mol/L組、20 μ mol/L組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移分別為134.33±1.89、115.33±2.05、 82.67±2.36。那可丁可以抑制A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且隨著藥物濃度增加轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)目減少；與對照組比較，那可丁10 μ mol/L組、20 μ mol/L組A549轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.05） 。見圖4。

圖4 不同劑量那可丁作用下A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移比較Fig.4 The migration of A549 cells treated with different concentrations of noscapine

MMP2是調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性蛋白，檢測那可丁對MMP2調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組，那可丁10 μ mol/L組、20 μ mol/L組A549細(xì)胞中MMP2mRNA表達(dá)分別為1.01±0.27、 0.52±0.11、 0.39±0.06。不同濃度那可丁對MMP2蛋白及mRNA有一定程度抑制作用，隨著藥物濃度升高抑制作用增強，與對照組比較，那可丁10 μ mol/L組、20 μ mol/L組MMP2mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.05） 。見圖5。

圖5 不同濃度那可丁作用下A549細(xì)胞中MMP2表達(dá)比較Fig.5 MMP2 expression in A549 cells treated with different concentrations of noscapine

3 討論

那可丁結(jié)構(gòu)與秋水仙堿具有一定的相似性，在進(jìn)行抗腫瘤活性篩選的過程中發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗腫瘤活性，作用機制為微管蛋白抑制劑［7］。由前列腺癌研究教育基金會和 Med Insight 研究學(xué)院合作開展的研究［8］表明，前列腺癌動物模型中口服那可丁可以產(chǎn)生腫瘤抑制作用。第17屆國際前列腺癌治療進(jìn)展大會上公布的一項研究［9］顯示，那可丁有望成為治療前列腺癌的有效藥物。有研究［10-13］指出，那可丁通過作用于HIF-1 α和EGFR等促進(jìn)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移功能。

本研究探討了那可丁對A549細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)那可丁對A549細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，20 μ mol/L那可丁作用于A549細(xì)胞24 h抑制率接近50%。深入研究發(fā)現(xiàn)那可丁可以通過抑制A549細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)來抑制A549細(xì)胞增殖。Cyclin D1是G1/S細(xì)胞周期相關(guān)因子，可以誘導(dǎo)細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化，抑制了Cyclin D1表達(dá)可以將細(xì)胞阻滯于G1期，從而抑制了腫瘤細(xì)胞增殖［14］。通過檢測那可丁對A549細(xì)胞凋亡影響發(fā)現(xiàn)，那可丁可以促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，這一作用可能是通過抑制BCL-2蛋白和mRNA表達(dá)來實現(xiàn)的。

已有研究［15］表明肺癌細(xì)胞一旦發(fā)生侵襲遷移，患者的生存期極短，因此，藥物如果可以對肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用就能夠很好抑制肺癌的進(jìn)程。本研究通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)那可丁以劑量依賴的方式抑制肺癌細(xì)胞A549的遷移能力。有研究［15］報道MMP2在調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲的功能中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明那可丁以劑量依賴的方式影響MMP2的表達(dá)，與以往研究結(jié)果一致。

本研究認(rèn)為，那可丁能夠抑制A549細(xì)胞生長，其機制可能是通過抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1來抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，同時抑制BCL-2促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。那可丁也可以通過抑制MMP2蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)抑制細(xì)胞遷移的功能。本研究尚未對那可丁作用的具體信號通路途徑進(jìn)行深入探討，而且缺乏體內(nèi)實驗的印證，將在后續(xù)實驗中繼續(xù)深入研究。那可丁可以通過調(diào)節(jié)多種蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)抑制肺癌細(xì)胞A549生長和遷移的作用，由此推斷那可丁可能成為治療肺癌的潛在藥物。