王振興，王智超，吳雨瀟，張 秀，肖 瑋，李水芹，王 飛△

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075； 2. 曲靖市中醫(yī)醫(yī)院，云南 曲靖 655000； 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是多種炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的肺臟局部炎癥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)失控所致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[1]。近年來，隨著全球工業(yè)化和城市化建設(shè)的迅速發(fā)展，環(huán)境空氣污染成為新的全球疾病主導(dǎo)因素之一[2-3]。大氣污染特別是由于細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)所導(dǎo)致的霧霾天氣在全國各地區(qū)頻繁發(fā)生，已嚴(yán)重影響到公民的健康和生活質(zhì)量[3-5]。

黃芪是豆科多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，黃芪甲苷是其主要質(zhì)量控制成分[6]，具有較好的免疫調(diào)節(jié)、器官保護(hù)、抗炎和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用[7]。課題組前期將PM2.5視作中醫(yī)病因?qū)W中環(huán)境毒邪范疇[8]，并探討了益氣解毒法防治PM2.5所致疾病的有效治法[9]。本次研究采用PM2.5標(biāo)準(zhǔn)品氣管滴注染毒誘導(dǎo)ALI模型，造模前給予不同劑量黃芪甲苷進(jìn)行預(yù)防，并運(yùn)用HE染色、McGuigan病理評分、透射電子顯微鏡觀察黃芪甲苷對PM2.5所致ALI模型的早期形態(tài)學(xué)變化影響，探討黃芪甲苷對PM2.5誘導(dǎo)ALI的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量150～180 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司(合格證號SCXK(川)2015-030)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號：2017-03)，在成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟腑病證實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)。全程SPF級環(huán)境喂養(yǎng)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)溫度(25±1)℃，濕度(55±5)%，12 h晝夜交替，動物福利按照國際相關(guān)實(shí)驗(yàn)動物法規(guī)實(shí)施。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品SRM 2786(美國NIST)，黃芪甲苷(中國曼斯特，HPLC≥98.81%)，4%多聚甲醛(中國Bioshap)，DMSO(美國Sigma)，光學(xué)顯微鏡(日本NIKON)，透射電鏡(日本Hitachi)。

2 方法

2.1 細(xì)顆粒物及黃芪甲苷的配制

細(xì)顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品SRM 2786購于美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所，具體成分組成及成分分析詳見官網(wǎng)信息庫。使用前將SRM 2786溶解于生理鹽水，配置成SRM 2786混懸液，經(jīng)超聲15 min振蕩混勻后使用。黃芪甲苷溶解于1‰DMSO的生理鹽水中，制成混懸液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 分組給藥及造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按照隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組、模型組及黃芪甲苷低、中、高劑量組(12.5，25，50 mg·kg-1)各8只。ip給藥，每日2次，連續(xù)給藥3 d[10-11],假手術(shù)組給予等體積溶劑。造模方法參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12-13]，造模前12 h禁食，末次給藥30 min后，SRM2786混懸液氣管滴注(劑量為7.5 mg·kg-1b/周；每只大鼠滴注體積按1.5 ml·kg-1b/周計(jì)算；每日1次，隔日滴注1次，共計(jì)2次)誘發(fā)大鼠ALI模型。假手術(shù)組氣道滴注等體積生理鹽水，末次滴注0.5 h后[14]，右股動脈放血處死大鼠。

2.3 大鼠一般狀況和肺組織形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)期間，全程詳細(xì)觀察記錄各組大鼠的飲食狀況、呼吸狀況、精神神態(tài)、被毛光澤和活動度等指標(biāo)，記錄大鼠死亡情況。處死大鼠后，肉眼觀察肺瘀血和肺腫脹程度。

2.4 HE染色及McGuigan病理評分

取每只大鼠右側(cè)肺臟尖葉，經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h，酒精脫水，二甲苯透明，制成石蠟切片，切片厚度4 μm備用，經(jīng)HE染色后觀察病理改變。ALI程度判定采用McGuigan病理評分法[15]，根據(jù)肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚或透明膜形成，分別進(jìn)行0～4分半定量分析。0分：無病變或非常輕微；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變；4分：極重度病變。McGuigan病理評分由兩位病理科醫(yī)師盲法判定評分結(jié)果。

2.5 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)

取0.1×0.1×0.1 cm3右側(cè)中葉肺組織，即刻放入滴有三氯乙醛固定液的載玻片上，用載玻片輕壓肺組織直到小氣泡消失為止。將組織固定24 h后，用pH 7.0的PBS清洗樣本3次，每次15 min。然后用1%鋨酸溶液固定樣品2 h，去除固定液，第二次用pH 7.0的PBS漂洗樣品3次，每次15 min。隨后用不同濃度的乙醇對樣本進(jìn)行脫水處置，每種濃度浸潤15 min后再用10%的乙醇浸潤 20 min，最后用100%丙酮浸透。丙酮和包埋劑混合，按1∶1比例將樣品在混合液中浸潤1 h，70 ℃下過夜。將處理好的肺組織切成厚度為50 nm的切片，并用枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色，用透射電鏡觀察肺組織全貌、局部和細(xì)胞器，重點(diǎn)觀測各實(shí)驗(yàn)組肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況和肺組織形態(tài)學(xué)觀察

所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間無死亡。麻醉蘇醒后，假手術(shù)組大鼠呼吸平穩(wěn)，精神活動恢復(fù)快，爪甲嘴唇無發(fā)紺和分泌物，對外界刺激反應(yīng)正常，有進(jìn)水現(xiàn)象。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠活動量明顯降低，出現(xiàn)皮毛直立現(xiàn)象、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、胸腹部喘息明顯等，偶有喘鳴音，唇舌黏膜發(fā)紺，鼻部有少量黑色粉末狀分泌物，無進(jìn)水進(jìn)食。與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組大鼠的活動量、皮毛色澤、唇舌黏膜等一般狀況均有改善，無胸腹部喘息，鼻部可見少量黑色粉末狀分泌物，偶有皮毛直立現(xiàn)象，其中黃芪甲苷中、高劑量組精神較好，偶有飲水。

肉眼觀察肺組織，假手術(shù)組兩肺外觀呈現(xiàn)淡粉紅色，顏色均勻，包膜完整，質(zhì)地軟、彈性好，無瘀血點(diǎn)和腫脹。模型組兩肺腫脹，顏色暗紅，雙肺彌漫分布深紅色出血點(diǎn)，在肺表面出現(xiàn)明顯瘀血和水腫，質(zhì)地相對粗糙。黃芪甲苷低、中劑量組與模型組比較，雙肺顏色較假手術(shù)組較深，體積略膨大，偶見散在出血點(diǎn)，但瘀血、水腫程度有所降低；黃芪甲苷高劑量組雙肺呈粉紅色，基本無出血點(diǎn)和瘀血，雙肺的損傷程度在給藥組中最輕。

3.2 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果

假手術(shù)組肺泡大小正常未見充血，肺組織基本未見出血，肺泡腔和血管壁可見少量中性粒細(xì)胞，未見肺泡壁增厚。模型組可見肺泡充血增多，肺組織明顯出血，肺泡腔和血管壁明顯可以觀察到中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡壁明顯增厚。黃芪甲苷各劑量組肺泡和肺組織基本未見出血，肺泡腔和血管壁中中性粒細(xì)胞浸潤。其中，低劑量組肺泡腔和血管壁中中性粒細(xì)胞程度比中、高劑量組增多，低劑量組肺泡壁一定程度比高劑量組增厚，與中劑量組無明顯差異。

3.3 各組大鼠肺組織McGuigan病理評分結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組病理總積分顯著升高(P<0.01)，其中肺泡充血、出血、肺泡壁增厚或透明膜形成3項(xiàng)積分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組病理總積分均顯著降低(P<0.01)，其中中、高劑量組在中性粒細(xì)胞炎性浸潤或聚集上明顯優(yōu)于低劑量組(與低劑量組比較，P<0.01)。此外，各給藥組肺泡結(jié)構(gòu)較完整，基本無出血現(xiàn)象，其中高劑量組效果最優(yōu)(與模型組比較，P<0.01)，中劑量組與低劑量組病變程度相似。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.黃芪甲苷12.5 mg·kg-1組；D. 黃芪甲苷25 mg·kg-1組；E. 黃芪甲苷50 mg·kg-1組(圖2同)圖1 各組大鼠肺組織病理HE染色結(jié)果比較(×100)

3.4 各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

假手術(shù)組顯示，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，肺泡上皮細(xì)胞排列整齊，邊緣清晰，無腫脹，無炎性浸潤，無明顯基底膜增厚，細(xì)胞核呈圓形；偶見肺泡巨噬細(xì)胞，細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞內(nèi)線粒體呈現(xiàn)桿狀，雙層膜結(jié)構(gòu)正常，線粒體內(nèi)嵴排列完整，未見腫脹或變形。

表1 實(shí)驗(yàn)藥物對大鼠肺組織McGuigan病理評分影響比較

注：與模型組比較：*P<0. 05，**P<0. 01；與假手術(shù)組比較：▲P<0. 05，▲▲P<0. 01；與黃芪甲苷低劑量組比較：◆◆P<0. 01

圖2 各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)比較(×25000)

模型組可見，肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、壞死、脫落，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部分板狀小體溶解呈排空狀，細(xì)胞核邊緣不完整，呈現(xiàn)不規(guī)則外形，甚至呈現(xiàn)核固縮現(xiàn)象；肺泡巨噬細(xì)胞較假手術(shù)組增多，細(xì)胞器內(nèi)可見黑色顆粒物，線粒體腫脹明顯，線粒體體積較假手術(shù)組增加，甚至形成巨型線粒體，部分內(nèi)嵴斷裂、消失或顏色變淺，內(nèi)皮外基膜不完整。

黃芪甲苷各給藥組超微結(jié)構(gòu)較為類似，肺泡上皮細(xì)胞邊緣完整，體積略增大，細(xì)胞質(zhì)均勻，板層小體空泡化少，肺泡腔內(nèi)脫落的炎性細(xì)胞較少，滲出物較少，細(xì)胞核較完整；高劑量給藥組低較、中劑量給藥組在肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量上明顯減少，細(xì)胞器內(nèi)可見黑色顆粒物，線粒體體積較假手術(shù)組相似，但低劑量給藥組線粒體內(nèi)嵴偶見斷裂，內(nèi)外基本偶見不完整。

4 討論

PM2.5所致肺損傷是環(huán)境因素致病的典型代表，是呼吸系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)。PM是指懸浮在環(huán)境空氣中固體及液體顆粒的總稱，按其空氣動力學(xué)直徑分為超細(xì)顆粒物(PM0.1，≤0.1 μm)、細(xì)顆粒物(PM2.5，≤2.5 μm)以及粗顆粒物(PM10，≤10 μm)三類。一般來說，PM2.5具有更小的粒徑，并可吸附多種有機(jī)物、重金屬、病原微生物、酸性氧化物，故可以隨呼吸運(yùn)動進(jìn)入到下呼吸道，深達(dá)肺泡，甚至進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)及其他系統(tǒng)病變發(fā)生。大量流行病學(xué)研究顯示，PM2.5濃度升高所介導(dǎo)的肺損傷與呼吸系統(tǒng)疾病住院率、病死率密切相關(guān)[16]。長期暴露在PM2.5的環(huán)境中，可以顯著增加慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺癌、肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病風(fēng)險[17]。因此，深入研究PM2.5所致肺系疾病的發(fā)病機(jī)制及如何運(yùn)用中醫(yī)藥進(jìn)行防治，在當(dāng)下具有重要價值。

ALI是以肺微血管通透性增高引起的以肺泡-毛細(xì)血管受損為主要特征的急性炎癥性疾病，其主要病理學(xué)表現(xiàn)是急性肺水腫[1]。效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)失調(diào)是目前研究較為深入的病理機(jī)制[18]。研究顯示[19]，作為肺組織的主要防御者，肺泡上皮細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞損傷、功能紊亂在PM2.5刺激所誘導(dǎo)的ALI過程中扮演著重要角色。一方面[20]，肺泡上皮細(xì)胞在PM2.5的誘導(dǎo)下導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)減少、耗能增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，是肺水腫形成的重要原因。在此過程，中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)被激活，釋放大量炎性介質(zhì)、活性氧和蛋白酶加重肺水腫的形成。另一方面[21]，作為人體肺部的“清道夫”，肺泡巨噬細(xì)胞作為接觸和沉積PM2.5的重要靶器官，具有識別和吞噬PM2.5的重要作用。PM2.5可嚴(yán)重影響肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能，造成肺功能障礙；不僅如此，肺泡巨噬細(xì)胞與PM2.5中所吸附的重金屬接觸后會導(dǎo)致促炎因子分泌的增加，引起肺泡巨噬細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞的炎癥作用[22-23]。

與模型組比較，黃芪甲苷各給藥組能有效減輕ALI的肺泡充血、出血，減少中性粒細(xì)胞的浸潤和聚集，降低肺泡壁增厚或透明膜的形成。在肺損傷McGuigan病理評分上，與模型組比較，黃芪甲苷高劑量較低、中劑量組在肺損傷病理積分上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，黃芪甲苷各給藥組還能保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，保護(hù)前者的包膜完整性，降低后者在肺內(nèi)的聚集數(shù)量。通過以上結(jié)論可以推測，黃芪甲苷“益氣解毒”保護(hù)PM2.5誘導(dǎo)ALI可能的主要機(jī)制在于改善肺微血管通透性的基礎(chǔ)上，減少肺泡充血、出血，降低炎性細(xì)胞浸潤、黏附、遷移和激活；減輕失控的炎性因子對肺泡上皮細(xì)胞屏障的破壞，降低肺微血管的通透性；調(diào)節(jié)肺泡表面活性物質(zhì)，減輕肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬障礙，從而減輕巨噬細(xì)胞的免疫損傷?？傊?，本次實(shí)驗(yàn)在中醫(yī)學(xué)治未病思想的指導(dǎo)下，宏觀與微觀相結(jié)合，證實(shí)了黃芪甲苷能有效改善PM2.5誘導(dǎo)大鼠的生存狀態(tài)，減輕肺水腫和肺組織McGuigan病理評分，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防PM2.5所致ALI的目的，這為臨床防治PM2.5提供了新的思路。