莫大超，李君久，彭 亮，劉志遠(yuǎn)，王杰云，袁積汝

(廣東省東莞東華醫(yī)院 普外科，廣東 東莞 523110)

膽結(jié)石是一類由于人類膽囊內(nèi)形成的結(jié)石所引起的疾病，該疾病較為常見其患病率在美國大約為15%，而在歐洲則為4%～21%[1]。有研究表明大約1/4的60歲以上女性患有膽結(jié)石[2]。相較于西方國家我國的膽結(jié)石患病率較低，為5%左右[3]。大多數(shù)的膽結(jié)石患者并未表現(xiàn)出任何癥狀，而有10%～20%的患者會表現(xiàn)出腹部劇烈疼痛、惡心、嘔吐、甚至黃疸和高熱等癥狀[2]。

既往的流行病學(xué)研究已經(jīng)確定出了包括年齡、性別、營養(yǎng)素攝取[4-5]、糖尿病[6]等在內(nèi)的大量膽結(jié)石危險因素，而膽結(jié)石家族史對于膽結(jié)石的發(fā)病也存在著顯著性的影響[7]。既往基于雙生子的研究提示膽結(jié)石是一類環(huán)境與遺傳共同作用的復(fù)雜疾病，遺傳因素可以解釋25%的膽結(jié)石疾病表型差異[8]。針對膽結(jié)石，既往的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定了包括ABCG8，UGT1A1，GCKR等基因在內(nèi)的大量易感基因[9-11]。近期一項基于非洲和西班牙裔美國人的全基因組關(guān)聯(lián)研究提示TM4SF4基因的rs9843304位點與膽結(jié)石的疾病狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學(xué)意義[12]。然而由于復(fù)雜疾病遺傳背景差異的影響，該研究結(jié)果尚未在中國人群中得到有效驗證。本研究中我們基于中國廣東漢族群體的580名膽結(jié)石患者和1 140名健康對照，調(diào)查覆蓋整個TM4SF4基因區(qū)域的12個單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)基因型在膽結(jié)石病例和健康對照組中的分布情況，從而對其遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。

1 對象與方法

1.1 對象 研究對象包含在東莞東華醫(yī)院行膽囊切除術(shù)的580名膽結(jié)石患者(女性242例，男性338例)，以及1 140名經(jīng)B超檢查證實無膽結(jié)石的健康受試者(作為對照)。為了確保病例組和對照組的年齡盡可能的相匹配，我們所收集的樣本年齡差距控制在±3歲之內(nèi)。此外，為了避免出現(xiàn)可能的群體分層現(xiàn)象，本研究所包括的所有樣本均為來自于東莞及周邊地區(qū)出生和居住的中國漢族人群，且三代之內(nèi)沒有遷徙史。我們對膽結(jié)石的膽固醇含量進(jìn)行測量并分類，將膽固醇含量大于50%的膽結(jié)石歸類為膽固醇膽結(jié)石。本研究所納入的患者均為膽固醇膽結(jié)石。所有對照樣本均為在本醫(yī)院接受體檢且通過B超檢查證實無膽結(jié)石的個體，或因膽囊息肉或膽囊腺瘤而進(jìn)行膽囊切除術(shù)并被證實無膽結(jié)石的個體。所有受試者取5 mL靜脈血用于提取DNA。本研究經(jīng)東莞東華醫(yī)院的倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得每位患者的書面知情同意。

1.2 SNP位點選擇與基因分型 利用千人基因組數(shù)據(jù)庫中的北京漢族人群數(shù)據(jù)，選取TM4SF4基因內(nèi)最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)≥0.05且雜合度≥0.2的SNPs位點，共計136個。隨后基于這些SNPs以r2≥0.7為條件進(jìn)行標(biāo)簽SNP的遴選。最終，總共12個標(biāo)簽SNPs(rs9843304，rs73152651，rs9793，rs13062142，rs4681510，rs9880538，rs34447987，rs529680502，rs10460856，rs6440616，rs72615627，rs79586514)納入本研究的后續(xù)分析。依據(jù)DNA提取試劑盒說明書(Genomic DNA kit，Axygen Scientific Inc，CA，USA)的步驟提取外周血細(xì)胞中的基因組DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｎ猩虾ｅ渲旧锟萍脊煞萦邢薰臼褂酶咄縎equenomMassARRAY平臺(Sequenom，San Diego，CA，USA)對標(biāo)簽SNP進(jìn)行基因分型，并采用SequenomTyper 4.0軟件處理結(jié)果。整個基因分型過程中隱藏了樣品的病例/對照狀態(tài)。本研究中每個標(biāo)簽SNP以及整體基因分型成功率均大于99%。

1.3 統(tǒng)計分析 我們首先對所選12個SNP位點的基因型頻率和哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)情況進(jìn)行了分析，隨后通過Haploview等[13]對12個所選SNP的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)進(jìn)行了展示。最后我們采用χ2檢驗對12個所選SNP與膽結(jié)石疾病狀態(tài)的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了檢驗。此外我們利用線性回歸模型對具有統(tǒng)計學(xué)意義的SNP與四項血脂指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析。年齡、性別以及BMI作為協(xié)變量加入模型進(jìn)行校正。主要的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析由遺傳學(xué)分析軟件Plink等[14]完成。本研究中我們采用Bonferroni校正對多重檢驗問題進(jìn)行處理，單位點關(guān)聯(lián)分析的P值閾值為0.05/12≈0.004。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)特征分析 本次研究對象的人口學(xué)特征信息如表1所示。本次研究中共納入膽結(jié)石患者580名，健康對照1 140名。其中性別、年齡、BMI、血清總膽固醇、甘油三酯以及高密度脂蛋白水平在膽結(jié)石病例和健康對照患者中的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，只有低密度脂蛋白水平的名義P值小于0.05。

表1 本次研究納入樣本基本信息

2.2 遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析 本課題共選取覆蓋TM4SF4基因的12個單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)，我們在前期對這些SNP的MAF進(jìn)行計算并對其H-W平衡情況進(jìn)行檢驗，結(jié)果如表2所示。其中我們可以看出全部12個SNP的MAF均大于0.05，而且均處于H-W平衡狀態(tài)。

表2 本次研究所選12個SNP的基本信息

*：MAF:次等位基因頻率；**：HWE：哈迪溫博格平衡檢驗P值。

本次研究所選擇的12個SNP位點的連鎖不平衡圖譜如圖1所示，由于本次研究選擇的為標(biāo)簽SNP，因此不同SNP間的連鎖不平衡并不顯著，獨立性較好。表3展示了針對TM4SF4基因的12個SNP的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。經(jīng)過多重檢驗校正，只有rs9843304位點與膽結(jié)石的疾病狀態(tài)的關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.27，P=0.0008)。rs9843304位點的C等位基因可以顯著性的提高膽結(jié)石在人群中的發(fā)病危險度，該等位基因在膽結(jié)石病例組中的等位基因頻率為0.53，而在對照組中這一數(shù)值為0.47。此后針對rs9843304位點與4種血脂指標(biāo)的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)包括血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白在內(nèi)的四種血脂指標(biāo)與rs9843304位點基因型的關(guān)聯(lián)不具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表4)。

圖1 12個SNP位點的連鎖不平衡圖譜

表3 針對TM4SF4基因的12個SNP的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

(表注)顯著性結(jié)果加粗顯示。

表4 顯著性位點rs9843304與四種生化指標(biāo)的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

3 討論

TM4SF4基因編碼的蛋白為四跨膜蛋白家族的一種。這類蛋白通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了細(xì)胞的發(fā)育、激活、生長和運動的調(diào)節(jié)[15]，而TM4SF4蛋白則作為一種細(xì)胞表面糖蛋白參與了細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[15]。既往研究表明TM4SF4基因編碼的蛋白在肝臟的再生和胰腺發(fā)育中起到了重要的作用[16]，既往針對該基因的RNA測序分析顯示該基因在人類膽囊組織中表達(dá)量較高，尤其是在慢性膽囊炎及膽結(jié)石患者中表達(dá)量更高[12]。這些結(jié)果提示TM4SF4基因在膽結(jié)石的發(fā)病和發(fā)展過程中可能存在著一定作用，但其具體機(jī)制尚未明晰。通過檢索GTEx數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SNP rs9843304在人類睪丸、甲狀腺以及胰腺組織中均可以顯著性的影響TM4SF4基因的表達(dá)[17]。該位點的C等位基因在睪丸和甲狀腺組織中與TM4SF4基因的高表達(dá)相關(guān)，而在胰腺組織中則作用相反。這一結(jié)果提示SNP rs9843304可能是通過對TM4SF4基因表達(dá)的影響進(jìn)而作用于膽結(jié)石的發(fā)病過程的。但是由于GTEx數(shù)據(jù)庫并未記錄膽結(jié)石疾病靶組織數(shù)據(jù)，因此未來還需要生物實驗來對SNP位點rs9843304的作用進(jìn)行驗證。

本次研究針對覆蓋TM4SF4基因區(qū)域的12個SNP與膽結(jié)石的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了考察。研究結(jié)果表明rs9843304位點與膽結(jié)石的疾病狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)果與較早前基于非洲裔和西班牙裔美國人的全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果基本一致。rs9843304位點位于TM4SF4基因內(nèi)含子區(qū)域，因此其并不具有改變TM4SF4基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能。本次研究所發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)信號有可能是通過與潛在的易感位點存在連鎖不平衡而產(chǎn)生的，也可能是由于其對TM4SF4基因的表達(dá)有一定調(diào)控作用。如果是前者那么基于基因測序技術(shù)的研究設(shè)計可以幫助我們明晰這些潛在的易感位點，而如果是后者那么未來針對該位點的生物學(xué)功能研究則有待展開。此外，由于本研究并未采集進(jìn)行分層分析的相關(guān)數(shù)據(jù)，由于信息不足可能使得本研究結(jié)果的應(yīng)用價值受到一定限制。

本次研究還針對rs9843304位點與4種血脂指標(biāo)的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析，分析結(jié)果顯示這4種血脂指標(biāo)與rs9843304位點基因型之間的關(guān)聯(lián)不具有統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果提示rs9843304位點與膽結(jié)石疾病狀態(tài)的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)可能并未通過血脂指標(biāo)進(jìn)行中介，其對于膽結(jié)石疾病的影響可能是獨立的遺傳學(xué)作用。當(dāng)然，由于樣本量的限制，這些陰性結(jié)果也可能是由于有限的統(tǒng)計學(xué)效能所致，未來結(jié)合更大規(guī)模樣本的驗證性研究亟待展開。

本次研究基于來自于中國廣東地區(qū)漢族人群的580名膽結(jié)石患者和1 140名健康對照，選取了覆蓋TM4SF4基因的12個SNP位點并考察了這些位點與膽結(jié)石疾病狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性。我們的研究在中國群體中驗證了TM4SF4基因rs9843304位點與膽結(jié)石的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學(xué)意義，從群體遺傳學(xué)的角度為TM4SF4基因與膽結(jié)石疾病機(jī)制的聯(lián)系提供了證據(jù)。