楊 雨，陳 琦

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099； 2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

Burkitt淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL)是最具侵襲性的非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)亞型之一，患者多以盜汗、乏力、皮膚瘙癢、體重下降為主要臨床表現(xiàn)[1]?，F(xiàn)治療上以環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、阿霉素和地塞米松(hyper-CVAD方案 )化療為主，大多數(shù)患者預(yù)后良好。然而，包括腫瘤溶解、感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)在內(nèi)的并發(fā)癥以及化療毒副作用嚴(yán)重影響患者的治療效果，因此研究BL的其它治療方法具有重要意義[2-4]?？扇苄訡D40配體(soluble CD40 ligand，sCD40L)屬于腫瘤壞死因子超家族成員，其與CD40的配體-受體藕聯(lián)在機(jī)體的體液免疫及細(xì)胞免疫中起重要作用，被認(rèn)為是一種具有治療癌癥潛力的共刺激分子[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)sCD40L對(duì)人B細(xì)胞淋巴瘤BJAB細(xì)胞的增殖有抑制，誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax、Caspase-9，及下調(diào)BCL-2蛋白的表達(dá)以及干擾細(xì)胞周期有關(guān)[6]，提示sCD40L可通過(guò)刺激死亡受體途徑和線粒體途徑，改變細(xì)胞周期細(xì)胞分布來(lái)促進(jìn)B淋巴瘤細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞的增殖。本文通過(guò)檢測(cè)sCD40L對(duì)人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞株增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及MAPK通路相關(guān)因子ras、raf、MEK、ERK1/2 在mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討sCD40L對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的其它類型或細(xì)胞系的可能作用機(jī)制，并為其能否運(yùn)用于BL的治療而提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人Burkitt's淋巴瘤Raji細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞資源中心；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；sCD40L購(gòu)自以色列ProSpec公司；CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自Dojindo公司和上海七海富泰生物科技有限公司；RT-PCR的試劑購(gòu)自Takara 公司，引物由生工生物工程股份有限公司購(gòu)買。一抗(小鼠抗人)ras、ERK1/2購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，raf、MEK、GAPDH購(gòu)自Abcam公司；二抗(羊抗兔)由Cell Signaling Technology公司購(gòu)買。

1.2 方法

1.2.1 Raji細(xì)胞培養(yǎng) Raji細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，以90%RPMI1640及10%胎牛血清配置的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2天換液，2～3 d傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，聚團(tuán)數(shù)多而均勻且呈對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)sCD40L 對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，聚團(tuán)情況良好的Raji細(xì)胞細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白調(diào)零組，將細(xì)胞離心重懸并以細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)/孔接種96孔板，每孔 50 μL，每組6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加入sCD40L母液50 μL，使終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4 μg/mL；對(duì)照組和空白調(diào)零組分別添加完全培養(yǎng)基，使終體積為100μL/孔。分別培養(yǎng) 24、48、72 h后，快速向各孔加入10 μL CCK-8試劑，避光混勻，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的OD值；并計(jì)算Raji細(xì)胞生存率：生存率=[(OD 對(duì)照組-OD 實(shí)驗(yàn)組)/(OD 對(duì)照組-OD 空白組)]×100%。

1.2.3 Annexin/PI 雙染法檢測(cè)Raji細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Raji細(xì)胞以3×105個(gè)/孔，鋪于6孔板，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入濃度為4 μg/mL的sCD40L，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h。離心收集并用PBS清洗細(xì)胞，Annevix Binding Buffer稀釋后取100μL重懸；加入5μL Annevix FITC，室溫避光孵育15 min，再加入5μL PI，室溫避光孵育10 min，補(bǔ)加150 μL Annevix Binding Buffer后上機(jī)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)和分析。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Raji細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Raji細(xì)胞以3×105個(gè)/孔，鋪于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入濃度為4 μg/mL的sCD40L，對(duì)照組補(bǔ)充同體積的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24、48、72 h分別后收集細(xì)胞，PBS清洗重懸細(xì)胞，再逐滴加入到-20℃預(yù)冷的乙醇中，4℃固定過(guò)夜；PBS清洗，去除乙醇，加入200～300 μL PI/RNase染液，室溫避光孵育15 min，上機(jī)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)ras、raf、MEK、ERK1/2的mRNA水平表達(dá) 取濃度為 1×106個(gè)/mL的Raji 細(xì)胞懸液 0.5mL 接種于24 孔板中，設(shè)置sCD40L濃度為4 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組及不加sCD40L的對(duì)照組，分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集細(xì)胞，提取RNA，通過(guò)OD260/OD280比值測(cè)定RNA純度和含量。按照如表1所示體系，于37℃ 15 min逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，85℃ 5 s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

表1 逆轉(zhuǎn)錄體系

逆轉(zhuǎn)錄完畢后，按Takala試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其擴(kuò)增體系總反應(yīng)體積為20 μL，包括cDNA 1 μL；SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL；上下游引物2 μL；DEPC水7 μL。各基因引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表2。PCR預(yù)變性95 ℃ 30 s，1 cycle，擴(kuò)增反應(yīng)為95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，40 cycle。計(jì)算2^-ΔΔCt以判斷各基因表達(dá)量的變化。

表2 各基因引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.2.6 Western blot測(cè)定ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白水平的變化 收集濃度為4 μg/mL的sCD40L處理24、48、72 h后的細(xì)胞，用PBS清洗2次后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心收集上清以BCA法測(cè)定蛋白濃度。配置SDS聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，分別灌制玻璃板，裝置電泳槽，加入電泳緩沖液，點(diǎn)加樣本和預(yù)染Marker，通電進(jìn)行電泳。制作轉(zhuǎn)膜裝置通電1.5 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride membrane,PVDF)膜上，脫脂奶粉室溫封閉1h后分別與一抗和二抗孵育。一抗為鼠抗人單克隆抗體，分別為ras (1∶1 000)、raf (1∶1 000)、MEK (1∶1 000)、ERK1/2 (1∶1 000)、GAPDH (1∶3 000)；二抗稀釋比例為1∶5 000。與抗體結(jié)合后的PVDF膜洗滌后經(jīng)ECL試劑盒顯色并曝光，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J通過(guò)灰度值分析檢測(cè)各蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞體外增殖的影響 不同濃度sCD40L對(duì)人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞作用24、48、72 h后對(duì)其生存率均有抑制作用；隨著濃度和時(shí)間的增大，sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞生存率的影響越大。如表3所示，sCD40L 和Raji細(xì)胞作用24 h后，濃度為4 μg/mL與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，余下各濃度組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。sCD40L 和Raji細(xì)胞作用48 h，濃度為1、2、4 μg/mL與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；sCD40L 和Raji細(xì)胞作用72 h，所有濃度組與對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而同一濃度不同時(shí)間下，濃度為1、2、4 μg/mL的作用Raji細(xì)胞48 h后與24 h相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。濃度為0.5、1、2、4 μg/mL的作用72 h后與24、48 h相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。提示sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞生存率的影響具有劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。其中以sCD40L的最大濃度為4 μg/mL對(duì)Raji細(xì)胞抑制作用最明顯，以72 h抑制作用最明顯，與其它時(shí)間相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同時(shí)間和濃度sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞生存率的影響

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；△：與24 h比較，P<0.05；▲：與48 h，P<0.05。

2.2 Annexin/PI 雙染法檢測(cè)Raji細(xì)胞凋亡 以濃度為4 μg/mL為干預(yù)濃度的sCD40L 作用24、48、72 h后，Raji細(xì)胞的凋亡率見(jiàn)表4所示，分別與對(duì)照組相同時(shí)間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示隨著sCD40L 作用時(shí)間延長(zhǎng)，Raji細(xì)胞凋亡率逐漸增高。

表4 不同時(shí)間4 μg/mL sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞凋亡率的影響

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；△：與24 h比較，P<0.05；▲：與48 h，P<0.05。

A、B、C分別為sCD40L干預(yù) Raji細(xì)胞24 h、48 h、72 h后凋亡情況圖1 不同時(shí)間sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)sCD40L對(duì)細(xì)胞周期的影響 濃度為4 μg/mL的sCD40L與Raji細(xì)胞共育24、48、72 h后，細(xì)胞在G0/G1期所占比例分別與對(duì)照組同時(shí)間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，S期及G2/M期細(xì)胞所占比例較對(duì)照組有所降低；實(shí)驗(yàn)組各周期之間對(duì)比有差異(P<0.05)。結(jié)果(見(jiàn)表5)提示sCD40L可能阻滯Raji細(xì)胞在G0/G1期。

表5 不同時(shí)間sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞周期分布影響

*：與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)sCD40L對(duì)ras、raf、MEK、ERK1/2mRNA的影響 以濃度為4 μg/mL的sCD40L與Raji細(xì)胞分別共育24、48、72 h后，ras mRNA、raf mRNA、MEK mRNA、ERK1/2 mRNA表達(dá)量變化提示隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各基因表達(dá)量呈降低趨勢(shì)。以上各基因表達(dá)量與同時(shí)間細(xì)胞對(duì)照組比較均有差異(P<0.05)，結(jié)果(見(jiàn)表6)。

表6 不同時(shí)間4 μg/mL sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞ras、raf、MEK、ERK1/2 mRNA表達(dá)的影響

*：與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.5 Western blot測(cè)定ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白水平的變化 以濃度為4 μg/mL的sCD40L作用Raji細(xì)胞24、48、72 h后，ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白表達(dá)量變化結(jié)果提示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白表達(dá)量呈降低趨勢(shì)(見(jiàn)圖2)，raf蛋白24 h實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量與同時(shí)間對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其余時(shí)間及其他蛋白實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果(見(jiàn)表7、圖2)。

表7 不同時(shí)間4 μg/mL sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞ras、raf、MEK、ERK1/2 蛋白表達(dá)的影響

*：與對(duì)照組比較，P<0.05。

*：濃度為4 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組與空白細(xì)胞對(duì)照組組間比較，P<0.05；n=3。圖2 4 μg/mL的sCD40L對(duì)Raji細(xì)胞中ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

BL是起源于生發(fā)中心B細(xì)胞的一種具有高度侵襲性的淋巴瘤，組織學(xué)上以中等大小的彌漫性單形多核仁B細(xì)胞的高增殖和頻繁的有絲分裂為表現(xiàn)[7]，其B細(xì)胞異?？寺U(kuò)增常導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤溶解，因而患者常伴有乳酸脫氫酶(LDH)升高[8]。大多數(shù)BL患者通過(guò)強(qiáng)化化療治愈，然而，老年患者和復(fù)發(fā)患者的預(yù)后較差，因而進(jìn)一步促使我們探索更多新的方案來(lái)治療BL。

CD40是腫瘤壞死因子受體(TNFR)成員，在B細(xì)胞表面表達(dá)，常以膜結(jié)合性CD40L(mCD40L)與T細(xì)胞相互作用并輔助免疫應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)揮抗原遞呈方面的作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)CD40在抗體親和力成熟、生發(fā)中心形成和記憶B細(xì)胞的發(fā)育方面存在缺陷[10]，提示機(jī)體的腫瘤免疫應(yīng)答異常或低下可能與CD40信號(hào)通路低表達(dá)或受抑制有關(guān)，且CD40的信號(hào)作用可能影響B(tài)細(xì)胞淋巴瘤的轉(zhuǎn)歸，因此CD40L可能與CD40受體的藕聯(lián)，通過(guò)參與調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路因子的平衡而達(dá)到調(diào)控腫瘤，特別是B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)展[11]。本實(shí)驗(yàn)中隨著sCD40L濃度增加，對(duì)Raji細(xì)胞生存率的抑制也逐漸增高，提示sCD40L作用于Raji細(xì)胞后其抑制作用呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。以濃度為4 μg/mL為干預(yù)濃度的sCD40L 作用24、48、72h，Raji細(xì)胞的凋亡率逐漸增高，72 h凋亡率最高，提示 sCD40L 濃度為4 μg/mL 時(shí)，可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的凋亡，隨著sCD40L 作用時(shí)間延長(zhǎng)，Raji細(xì)胞凋亡率逐漸增高。

在信號(hào)通路相關(guān)基因變化與細(xì)胞凋亡的研究中，除外膜上的死亡受體途徑和胞質(zhì)內(nèi)的線粒體途徑，這兩條經(jīng)典途徑的上游及傳導(dǎo)過(guò)程中還受到MAPK信號(hào)通路的調(diào)控[12]。國(guó)外在高血壓與周圍血小板活化相關(guān)關(guān)聯(lián)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)CD40L能誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)(星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)的激活，并刺激NF-кB和MAPK相關(guān)炎癥因子的增加，最后使正常細(xì)胞炎性死亡而造成神經(jīng)炎癥和神經(jīng)損傷[13]。Wang等發(fā)現(xiàn)CD40L能夠在翻譯前水平上調(diào)Graves眼病患者眼眶成纖維細(xì)胞中VCAM-1和e-選擇素的表達(dá)[14]。上述實(shí)驗(yàn)研究表明CD40L與MAPK通路有關(guān)聯(lián)，前者在誘導(dǎo)NF-κB，激活PI3K以及MAPK通路引發(fā)的相關(guān)炎癥反應(yīng)中起到重要作用。

MAPK通路包含不同的信號(hào)級(jí)聯(lián)，其中ras/raf/MEK/ERK1/2(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2)是人類腫瘤中最常失調(diào)的信號(hào)級(jí)聯(lián)之一[15]，該級(jí)聯(lián)的各通路因子也是誘發(fā)性腫瘤形成和發(fā)展的主要中介物。有研究表明SDC-1可通過(guò)阻斷人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的JAK1 / STAT3和ras / raf / MEK / ERK途徑來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移[16]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CREBBP突變可能有助于增強(qiáng)急性淋巴細(xì)胞白血病中的致癌RAS信號(hào)傳導(dǎo)[17]。Crassini等發(fā)現(xiàn)包括由B細(xì)胞，Toll樣和趨化因子受體介導(dǎo)的信號(hào)通路會(huì)聚于raf-1 / MEK / ERK1 / 2-MAPK途徑，從而調(diào)控慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukaemia,CLL)細(xì)胞的存活和增殖。而MEK1 / 2抑制劑比美替你(Binimetinib)可通過(guò)下調(diào)Mcl-1活性顯著提高與表達(dá)CD40L的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的CLL細(xì)胞對(duì)BH3模擬物的敏感性和對(duì)Bim(BCL2L11)和Bcl-xL(BCL2L1)表達(dá)，從而對(duì)CLL細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用[18]。另有研究表明，實(shí)驗(yàn)肽EP2014 / 064243可通過(guò)干預(yù)Ras與Raf相互作用結(jié)合位點(diǎn)增強(qiáng)環(huán)磷酰胺的抗腫瘤作用，及其在小鼠侵襲性淋巴瘤中的促凋亡特性[19]。阿帕替尼(Apatinib)在體外和體內(nèi)均對(duì)各種類型的NHL細(xì)胞(包括BL，套細(xì)胞淋巴瘤和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤GCB或ABC型)顯示出顯著的細(xì)胞毒活性，其抗NHL活性可能與靶向VEGFR2及其下游的ras / raf / MEK / ERK途徑從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡以及抗血管生成有關(guān)[20]。上述相關(guān)研究提示ras/raf/MEK/ERK是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖和凋亡的重要途徑，而干預(yù)MAPK通路相關(guān)因子可能是靶向治療血液系統(tǒng)腫瘤特別是淋巴瘤的關(guān)鍵之一。

結(jié)合本課題組前期對(duì)sCD40L在惡性血液腫瘤的研究，以及在炎癥反應(yīng)中，CD40L對(duì)MAPK通路有影響和調(diào)控的作用，再聯(lián)系抑制MAPK通路相關(guān)因子作為治療腫瘤靶點(diǎn)的作用機(jī)制，提示利用sCD40L可能會(huì)直接通過(guò)抑制MAPK通路改變細(xì)胞周期分布并達(dá)到抑制增殖和促進(jìn)凋亡的抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)中sCD40L處理Raji細(xì)胞24、48、72h后，raf、ras、MEK、ERK1/2 mRNA的表達(dá)量呈降低趨勢(shì)且與對(duì)照組相比較均有差異(P<0.05)，說(shuō)明sCD40L在體外對(duì)Raji細(xì)胞增殖抑制及促進(jìn)其凋亡的機(jī)制可能與ras、raf、MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白表達(dá)的下調(diào)有關(guān)，提示與該級(jí)聯(lián)為代表的MAPK通路失活相關(guān)。

MAPK通路相關(guān)信號(hào)因子能與細(xì)胞周期進(jìn)行關(guān)聯(lián)，通過(guò)作用細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及其調(diào)節(jié)抑制劑等關(guān)鍵蛋白以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的分布。p21作為CDK抑制劑除抑制G1 CDK細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物，還具有通過(guò)結(jié)合并抑制增殖細(xì)胞核抗原來(lái)抑制DNA合成的能力[21]。p21蛋白的表達(dá)受RAS相關(guān)因子5(NORE1A / RASSF5)調(diào)節(jié)，在腫瘤發(fā)展中NORE1A表達(dá)經(jīng)常被啟動(dòng)子甲基化下調(diào)[22]。在結(jié)構(gòu)上，NORE1A含有RAS結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以GTP依賴性方式直接結(jié)合RAS癌蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞周期S期細(xì)胞數(shù)量減少，促進(jìn)RAS依賴性和非依賴性的細(xì)胞凋亡[23]。在本實(shí)驗(yàn)用濃度為4 μg/mL的sCD40L處理24、48、72 h后，Raji細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞比例增加，S、G2/M細(xì)胞比例降低，與對(duì)照組相比有差異(P<0.05)，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中ras mRNA及蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間增加呈逐漸降低趨勢(shì)，提示可能與NORE1A蛋白表達(dá)上調(diào)抑制RAS因子的活化有關(guān)。

綜上所述，sCD40L在體外可抑制Raji細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，并將Raji細(xì)胞阻滯在G0/G1期，其機(jī)制可能與抑制MAPK通路相關(guān)因子ras、raf、MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為體外培養(yǎng)Raji細(xì)胞，在樣本量及時(shí)間和濃度的設(shè)定存在不足，以后將增加相關(guān)通路蛋白和激活或抑制劑從蛋白水平驗(yàn)證sCD40L對(duì)MAPK相關(guān)通路因子的抑制機(jī)制，并引入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探索sCD40L在體內(nèi)抗Burkitt淋巴瘤的效果。