丁天宇 黃慧學(xué) 陳貽威

[摘要]目的 對(duì)22批咳特靈片（膠囊）總黃酮含量和抗氧化活性進(jìn)行研究，探討咳特靈片（膠囊）總黃酮體外抗氧化活性。方法 以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法在510 nm對(duì)22（包括1批次過期品）批咳特靈片（膠囊）進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定;并以維生素C作為對(duì)比，以DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力作為指標(biāo)，對(duì)咳特靈片（膠囊）進(jìn)行體外抗氧化活性的測(cè)定。結(jié)果 21批有效期內(nèi)咳特靈片劑和膠囊的平均總黃酮含量、DPPH自由基、ABTS自由基清除率和Fe3+還原能力分別為12.57%、10.13%、77.44%、83.27%、54.51%、49.93%、0.15、0.13，均有清除DPPH自由基、ABTS自由基作用及對(duì)Fe3+的還原能力。結(jié)論 咳特靈片（膠囊）在一定濃度范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

[關(guān)鍵詞]咳特靈;體外抗氧化活性;總黃酮;片劑;膠囊

[中圖分類號(hào)] R284.1 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1674-4721（2019）12（b）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the in vitro antioxidant activity of total flavonoids from Keteling Tablets （Capsules） by a study on total flavonoid content and antioxidant activity of 22 batches of Keteling Tablets （Capsules）. Methods Taking rutin as the reference substance， the total flavonoid content of 22 batches （including 1 batch of expired products） of Keteling Tablets （Capsules） was determined by ultraviolet spectrophotometry at 510 nm. Vitamin C was used as a comparison， DPPH free radical scavenging ability， ABTS free radical scavenging ability， and Fe3+ reducing ability were taken as indicators to determine the in vitro antioxidant activity of Keteling Tablets （Capsules）. Results The average total flavonoid content， DPPH free radical scavenging rate， ABTS free radical scavenging rate and Fe3+ reducing ability of the 21 batches of Keteling Tablets and Capsules within the expiration date were 12.57%， 10.13%， 77.44%， 83.27%， 54.51%， 49.93%， 0.15， and 0.13， respectively， all showing ability of scavenging DPPH free radicals and ABTS free radicals and the ability to reduce Fe3+. Conclusion Keteling Tablets （Capsules） have strong antioxidant activity in a certain concentration range.

[Key words] Keteling; In vitro antioxidant activity; Total flavonoids; Tablets; Capsules

咳特靈片（膠囊）是中西藥復(fù)方制劑，由小葉榕干浸膏和馬來酸氯苯那敏組成，具有鎮(zhèn)咳平喘、消炎祛痰的功效，常用于治療咳喘及慢性支氣管炎[1]。小葉榕葉為?？浦参锛?xì)葉榕Ficus microcarpa L.f.干燥葉的提取物，在嶺南地區(qū)民間多用于治療咳嗽、痢疾、小兒夜啼等[2]。小葉榕干浸膏含有葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷等多種黃酮類成分[3]。當(dāng)呼吸道受到異物刺激時(shí)容易引發(fā)咳嗽，咳嗽在清除呼吸道異物時(shí)從而引發(fā)炎癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[3]，咳嗽是慢性支氣管炎的重要臨床特征，鎮(zhèn)咳祛痰和增加人體內(nèi)抗氧化能力，對(duì)治療慢性支氣管炎具有良好的效果。氧化損傷與人體內(nèi)疾病如呼吸道疾病、心血管疾病等多種其他疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4]，因此，本研究對(duì)咳特靈片（膠囊）總黃酮抗氧化活性進(jìn)行探討，以期為咳特靈片（膠囊）治療慢性支氣管炎深入研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器

Infinite M200 PRO全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan）;SQP型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）;SB25-12D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2材料

蘆?。ㄅ?hào)：MVST-19010202），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所;維生素C（Vc），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽均購(gòu)于麥克林公司;氫氧化鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀均購(gòu)于成都金山化學(xué)試劑有限公司;乙醇購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司;甲醇、三氯醋酸購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑有限公司;22批咳特靈片（膠囊），其中片（P）（廣西廠家P1～5，廣東廠家P6～9，包括1批過期的廣東廠家P10），膠囊（J）（廣東廠家J1～9，江西廠家J10，吉林廠家J11～12）。

2方法與結(jié)果

2.1總黃酮含量測(cè)定

2.1.1蘆丁對(duì)照品溶液的制備 ?取蘆丁對(duì)照品5 mg，精密稱定，置于25 ml容量瓶中，加無水乙醇適量，超聲使溶解，放冷，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得到210 μg/ml的蘆丁對(duì)照品溶液，冷藏，備用。

2.1.2供試品溶液的制備 ?取咳特靈片20片，除去包衣后研細(xì)，精密稱取1.5 g;取咳特靈膠囊，將內(nèi)容物混勻，精密稱取1.4 g，置于50 ml容量瓶中，加70%甲醇適量，密塞，超聲45 min使其溶解，放冷，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3線性關(guān)系考察 ?精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 ml分別置于25 ml容量瓶中，各加純水至6 ml，加5%亞硝酸鈉1 ml，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁1 ml，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉10 ml，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照。用酶標(biāo)儀于510 nm處測(cè)定吸光度（OD）[5]。

2.1.4樣品總黃酮含量測(cè)定 ?將咳特靈片（膠囊）分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下樣品測(cè)定方法測(cè)定A值并計(jì)算總黃酮含量。

2.2體外抗氧化活性研究

2.2.1咳特靈DPPH清除能力的測(cè)定 ?0.1 mmol/L DPPH溶液的配置：精密稱取4 mg的DPPH，用無水乙醇定容至100 ml，4℃避光保存。

按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，用70%甲醇將樣品制成質(zhì)量濃度0.0112 mg/ml的供試品溶液，取2 ml不同濃度的樣品溶液，加2 ml現(xiàn)配的0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光放置30 min，以無水乙醇為空白在517 nm下測(cè)定其OD（A1）。2 ml的無水乙醇代替DPPH溶液，其余操作同上為空白（A2）。2 ml的無水乙醇代替樣品溶液，其余操作同上為空白（A0），Vc為陽性對(duì)照。根據(jù)以下公式計(jì)算咳特靈對(duì)DPPH自由基的消除能力：清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%[6-9]。

2.2.2去除ABTS自由基能力的測(cè)定 ?ABTS反應(yīng)液：精密稱取0.3841 g ABTS用超純水定容至100 ml，配制成7 mmol/L的ABTS溶液，精密稱取0.0662 g過硫酸鉀用超純水定容至100 ml，配制成2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液。將100 ml 7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，避光靜置16 h，得到ABTS反應(yīng)液，取1 ml ABTS反應(yīng)液加入100 ml無水乙醇，用無水乙醇逐級(jí)稀釋該溶液至吸光值為0.70±0.02。

將3.9 ml ABTS反應(yīng)液分別加入100 μl不同濃度的咳特靈溶液（A樣品）或乙醇溶液（A空白）在避光條件下反應(yīng)30 min，在734 nm下測(cè)定其吸光值，根據(jù)以下公式計(jì)算去除ABTS自由基能力：清除率（%）=[（A空白-A樣品）/A空白]×100%[10-12]。

2.2.3對(duì)Fe3+還原能力的測(cè)定 ?2.5 ml的磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）+2.5 ml K3Fe（CN）6（1%）。將1 ml不同濃度的咳特靈溶液分別加入反應(yīng)體系內(nèi)，50℃水浴20 min。后加入2.5 ml 10%三氯醋酸，1000 r/min離心10 min。取上清夜2.5 ml加入到2.5 ml蒸餾水和0.5 ml 0.1%的FeC13體系中。反應(yīng)10 min，在700 nm下測(cè)吸光值[13-16]。

2.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016、Graph pad 8軟件進(jìn)行分析，采用One way Anova進(jìn)行差異性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異顯著。

2.3結(jié)果

2.3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 ?按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下制備樣品溶液和對(duì)照品溶液，在波長(zhǎng)300～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，樣品溶液和對(duì)照品溶液在510 nm處有最大吸收，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm。

2.3.2線性范圍 ?以O(shè)D（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為A=11.545C-0.0169。結(jié)果表明，蘆丁在8.40～50.40 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好，r2=0.9994。

2.3.3總黃酮含量的測(cè)定 ?廣東廠家咳特靈膠囊和片劑中總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.45%和12.28%，廣西廠家咳特靈片劑中總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.80%，21批有效期內(nèi)咳特靈片劑和膠囊的平均總黃酮含量分別為12.57%、10.13%，具體結(jié)果見表1。

2.3.4咳特靈片（膠囊）對(duì)DPPH自由基的清除能力 ?由表1可知，21批有效期內(nèi)咳特靈片劑和膠囊的DPPH自由基自由基清除率分別為77.44%、83.27%，除過期咳特靈片劑P10外，不同廠家的咳特靈片和膠囊對(duì)DPPH自由基均有良好的清除作用。

2.3.5咳特靈片（膠囊）對(duì)ABTS自由基的清除能力 ?21批有效期內(nèi)咳特靈片劑和膠囊的ABTS自由基自由基清除率分別為54.51%、49.93%，咳特靈片（膠囊）質(zhì)量濃度為0.09、0.18、0.36 mg/ml時(shí)抗氧化活性均低于Vc，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）（表2）。提示不同廠家的咳特靈片（膠囊）對(duì)ABTS自由基均有良好的清除作用，且對(duì)ABTS自由基清除能力隨著藥液濃度的增加而增強(qiáng)。

2.3.6咳特靈片（膠囊）對(duì)Fe3+的還原能力 ?FRAP法測(cè)定總還原力，通過抗氧化劑將Fe3+還原為Fe2+，使藍(lán)色鐵離子絡(luò)合物的色澤消褪，通過在593 nm下測(cè)定其OD，通過測(cè)定其OD的變化，可以反映其還原能力的大小?？忍仂`片（膠囊）的總還原力隨著樣品濃度的增大OD逐漸升高，即在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，且相同濃度時(shí)抗氧化能力低于Vc（圖1）。21批有效期內(nèi)咳特靈片劑和膠囊的Fe3+的還原能力分別為0.15、0.13。

3討論

3.1咳特靈片（膠囊）總黃酮含量

通過對(duì)4個(gè)省22批咳特靈片和膠囊總黃酮含量的測(cè)定，結(jié)果提示，廣東咳特靈膠囊廠家較多且總黃酮含量相對(duì)其他地區(qū)較高，廣西咳特靈片總黃酮含量相對(duì)廣東較高;過期的咳特靈片劑總黃酮含量最低。

3.2咳特靈片（膠囊）的抗氧化活性

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，21批咳特靈片（膠囊）對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基均具有一定的清除作用，且具有較強(qiáng)的還原力。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，咳特靈片（膠囊）去除DPPH和ABTS自由基的能力及總還原力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，21批咳特靈中有15批DPPH自由基清除率超過80%，咳特靈片（膠囊）質(zhì)量濃度為0.09、0.18、0.36 mg/ml時(shí)抗氧化活性與陽性組比較有顯著性差異，不同廠家的咳特靈片（膠囊）對(duì)ABTS自由基均有良好的清除作用，且對(duì)ABTS自由基清除能力隨著藥液濃度的增加而增強(qiáng);其質(zhì)量濃度為0.18 mg/ml時(shí)，對(duì)Fe3+還原能力較強(qiáng)。

綜上所述，咳特靈片（膠囊）在一定濃度范圍，隨著含量的增加，抗氧化活性增強(qiáng)。

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（收稿日期：2019-05-07 ?本文編輯：任秀蘭）