張月霞 張立營 趙權(quán)

[摘要]流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種基于單顆粒的高通量、高內(nèi)涵檢測的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和臨床診斷，誕生至今已有52年的歷史。近年來，流式細(xì)胞儀在液路、光路和信號轉(zhuǎn)化、數(shù)據(jù)采集、計算等方面發(fā)展迅速，為個性化醫(yī)療背景下的血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等提供單細(xì)胞水平更快、更精、更廣的組學(xué)信息。目前我國FCM應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在免疫學(xué)、血液學(xué)、臨床腫瘤學(xué)和造血干細(xì)胞移植應(yīng)用等領(lǐng)域，本文總結(jié)了FCM的醫(yī)學(xué)應(yīng)用現(xiàn)狀與前景。

[關(guān)鍵詞]流式細(xì)胞術(shù);個性化醫(yī)療;醫(yī)學(xué)應(yīng)用現(xiàn)狀;前景

[中圖分類號] R733.71 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2019）12（a）-0028-03

Current status and prospects of medical application of flow cytometry

ZHANG Yue-xia1 ? ZHANG Li-ying1 ? ZHAO Quan2

1. Department of Clinical Laboratory， Navy Qingdao Special Service Center， Shandong Province， Qingdao ? 266071， China; 2. Department of Clinical Laboratory， Navy Qingdao 971 Hospital， Shandong Province， Qingdao ? 266071， China

[Abstract] Flow cytometry （FCM） is a high throughput and intensive detection technique based on single particle， which has been widely used in life science and clinical diagnosis for 52 years. In recent years， flow cytometer has developed rapidly in liquid， light and signal transformation， data acquisition， calculation， etc. In the context of personalized medical treatment， it provides faster， more precise and broader histological information for hematology， immunology， oncology， etc. At present， the application of FCM in China mainly focuses on immunology， hematology， clinical oncology and hematopoietic stem cell transplantation. This paper summarizes the current status and prospects of medical application of FCM.

[Key words] Flow cytometry; Personalized medical treatment; Medical application status; Prospects

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種生物技術(shù)，根據(jù)生物技術(shù)學(xué)科（例如計算機、流體力學(xué)和電子學(xué)），通過檢測標(biāo)記的熒光信號來檢測懸浮液中的單細(xì)胞或其他生物顆粒，其能夠在應(yīng)用中具體分析細(xì)胞，包括細(xì)胞功能，特性等，是一種實現(xiàn)高速、一對一的細(xì)胞定量和分選技術(shù)[1-2]。FCM目前被廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域。

目前，中國的FCM應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在以下幾個方面，①免疫學(xué)領(lǐng)域：FCM被用于評估人體的免疫功能狀況，可以被輔助診斷諸如獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）等免疫系統(tǒng)疾病。②血液學(xué)領(lǐng)域：FCM被用來對血液系統(tǒng)疾病的免疫分型和對白血病最小殘留病變（MRD）進(jìn)行有效監(jiān)測，通常被用來進(jìn)行血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療評估和可能的復(fù)發(fā)監(jiān)測。FCM的細(xì)胞免疫表型鑒定在診斷造血系統(tǒng)疾病時具有重大的意義，是最重要的國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)之一，目前已被廣泛接受并被認(rèn)為是一種免疫表型鑒定方法。③臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域：FCM可以了解DNA倍性和進(jìn)行細(xì)胞周期分析，DNA異常倍性的出現(xiàn)意味著DNA合成異?；蛘吆铣烧系K，這可能是腫瘤或癌前病變的重要標(biāo)志之一。④造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域：在器官移植領(lǐng)域，足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞對成功進(jìn)行造血干細(xì)胞移植非常重要，同時FCM還具有鑒定和計數(shù)造血的功能[3]。

1 FCM及流式細(xì)胞儀

1.1 FCM

是用流式細(xì)胞儀測量液相中懸浮細(xì)胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術(shù)，它是眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科技領(lǐng)域相結(jié)合的高科技結(jié)晶。FCM的主要方法是利用對流細(xì)胞術(shù)在懸浮細(xì)胞中的應(yīng)用，根據(jù)生物技術(shù)學(xué)科（例如計算機、流體力學(xué)和電子學(xué)）中的應(yīng)用知識進(jìn)行測量，并對細(xì)胞進(jìn)行特定分析，包括細(xì)胞功能和特性。近年來，隨著FCM的發(fā)展和進(jìn)步，它在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用已逐漸得到擴展，包括細(xì)胞生物測定、免疫功能分析、臨床腫瘤檢測、病理學(xué)分析、血液檢測等[4-5]。

1.2流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀的主要組成部分是：①流動室和液流系統(tǒng);②激光源和光學(xué)檢測系統(tǒng);③光電管和檢測系統(tǒng);④信號處理系統(tǒng)和信號分析系統(tǒng);⑤細(xì)胞進(jìn)行分類和篩選系統(tǒng)。

流式細(xì)胞儀的基本工作原理是：先通過激光測量鞘液中的染色細(xì)胞標(biāo)志物，然后記錄熒光強度、熒光寬度及散射光強度等參數(shù)。此外，根據(jù)熒光標(biāo)記的被檢測物質(zhì)的單克隆抗體的類型不同，對細(xì)胞成分進(jìn)行分析。

2 FCM的醫(yī)學(xué)應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 FCM在核酸檢測中的應(yīng)用

利用核酸染料觀察核型和細(xì)胞分裂是流式技術(shù)的最早應(yīng)用之一。FCM通過檢測插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基對的核酸熒光染料被激發(fā)后的熒光強度得以實現(xiàn)。通過分支DNA雜交探針技術(shù)檢測單細(xì)胞水平特異性mRNA，可以為研究和診斷提供準(zhǔn)確可追溯的細(xì)胞信息[6-7]，從而了解病變情況。

2.2 FCM在液相活檢中的應(yīng)用

BEAMing技術(shù)結(jié)合了數(shù)字PCR以及流式技術(shù)，其方法是每一類DNA分子都會專一的與磁性珠相連接，然后DNA分子之間的差異可以通過流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記來做出評估。這種方法是基于小珠（bead）、乳濁液（emulsion）、擴增（amplification）、磁性（magnetic）這四個主要組分來構(gòu)建的，所以被稱作為BEAMing。在液體活檢中進(jìn)行FCM，為低豐度基因如腫瘤來源的表皮生長因子受體（EGFR）、KRAS等基因以及Septin9基因甲基化的絕對定量檢測提供了幫助，BEAMing技術(shù)正為針對癌癥患者的靶向篩查、耐藥性監(jiān)測提供非侵入性的檢測保障[8-9]。

2.3成像流式細(xì)胞儀

成像流式細(xì)胞儀整合了FCM和熒光顯微鏡成像技術(shù)，基于單細(xì)胞圖像，獲得有關(guān)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞空間定位以及信號強度定量的完整信息[10-11]。既能提供細(xì)胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，又可以獲得單個細(xì)胞的圖像，從而提供了細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號分布更直觀、準(zhǔn)確的細(xì)胞水平完整信息。

2.4微流式細(xì)胞術(shù)

微流式細(xì)胞術(shù)是芯片實驗室的典范，具有便攜式、價格便宜、易于操作等特點，可以滿足軍事和疫區(qū)的快速檢測需求。而且，通過結(jié)合磁性微球可以分離并計數(shù)細(xì)胞。乳化液滴PCR和熒光標(biāo)記的Taqman探針用于擴增觀察對象的基因，以實現(xiàn)分選。細(xì)胞變形能力、拉曼全光譜和其他平臺用于細(xì)胞分選和準(zhǔn)確分析[12-13]。

2.5體內(nèi)流式細(xì)胞儀

體內(nèi)流式細(xì)胞儀使用可穿戴設(shè)備通過光聲、光熱、拉曼光譜、高速透射電子顯微鏡、多光子共聚焦成像等方法獲得異常的血管內(nèi)細(xì)胞，或用于非侵入性動態(tài)觀察分析的稀有細(xì)胞[14-15]。

2.6光譜流式細(xì)胞儀

光譜流式細(xì)胞儀的光路使用光柵代替二向色鏡或全光譜棱鏡。使用更靈敏的接收器[例如電荷耦合器件（CCD）]來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的光電倍增管（PMT）接收器。光譜流式細(xì)胞儀可以識別每個光譜信號的獨特形狀，而不是傳統(tǒng)的發(fā)射峰，終光譜信號可以通過計算機進(jìn)行解析判斷。表面增強拉曼散射（SERS）是光譜FCM的特定應(yīng)用之一[16-17]。

2.7質(zhì)譜流式細(xì)胞儀

質(zhì)譜流式細(xì)胞儀是一種使用質(zhì)譜儀對單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測的流動技術(shù)。它不僅繼承了傳統(tǒng)FCM高速分析的特點，并且具有高分辨率的質(zhì)譜分析能力。這是FCM的新發(fā)展方向。它是近年來出現(xiàn)的一種單細(xì)胞分析技術(shù)。首先用背景極低的金屬標(biāo)記物標(biāo)記樣品，單細(xì)胞水平觀察是通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和FCM進(jìn)行[18-19]。通過可視化和大數(shù)據(jù)計算，質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)在免疫表型、細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)分析和細(xì)胞亞群進(jìn)化等方面具有無與倫比的優(yōu)勢。

2.8 FCM在白血病診斷和治療監(jiān)測中的應(yīng)用

白血病屬于一種血液系統(tǒng)疾病。在各種急性白血病的診斷和鑒定中，一般形態(tài)學(xué)檢查難以有效區(qū)分不同類型的白血病，現(xiàn)今的FCM在白血病的診斷和治療監(jiān)測中起著關(guān)鍵作用。就白血病免疫表型而言，目前通常使用FCM CD45/SSC兩參數(shù)散射網(wǎng)設(shè)計方法進(jìn)行分型鑒定。這種方法可以清楚地將骨髓造血細(xì)胞分為粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、未成熟細(xì)胞和有核紅細(xì)胞群體，F(xiàn)CM能有效排除正常細(xì)胞對白血病免疫分型的干擾[20-22]。

2.9 FCM在腫瘤標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用

FCM通過檢測細(xì)胞中DNA含量的變化來檢測實體瘤。因此，F(xiàn)CM技術(shù)一直被認(rèn)為是病理形態(tài)學(xué)診斷中腫瘤診斷的重要方面。①FCM可以通過對腫瘤細(xì)胞的DNA倍體進(jìn)行分類，來鑒定腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性;②FCM可以通過分析腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖活性、凋亡水平和細(xì)胞分化，探索腫瘤細(xì)胞動力學(xué)的特征;③FCM可以對癌基因（ras基因家族、p21、bcl-2、cerbB-2、myc基因家族），抑癌基因（p53、RB、p16等），與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（CD44S、CD44V5、CD44V6、Nm23等），凋亡相關(guān)基因（caspases-3，膜聯(lián)蛋白V、Survivin、CD95和腫瘤相關(guān)抗原細(xì)胞角蛋白）進(jìn)行檢測和分析，可以用于研究腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)特征，從而為腫瘤的治療提供參數(shù);④FCM可以對腫瘤患者的淋巴細(xì)胞及其亞群、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞因子等進(jìn)行檢測和分析，從而可以探索腫瘤患者的免疫特征。

綜上所述，通過FCM檢測和分析腫瘤及相關(guān)細(xì)胞的各種參數(shù)，可以進(jìn)一步提高腫瘤診斷研究水平[23-25]。

3 FCM的前景與思考

FCM在國外已有十多年的歷史，在中國的應(yīng)用發(fā)展時間還很短，仍然存在很多不足。從FCM的誕生開始，F(xiàn)CM的應(yīng)用幾乎涵蓋了整個生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用越來越廣泛，尤其是越來越多地應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域[26-30]。流式細(xì)胞儀是高端精密儀器，要求使用者掌握和具備免疫學(xué)、血液學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科的知識和技術(shù)，且儀器價格昂貴，這些因素阻礙了FCM在國內(nèi)的應(yīng)用和普及。另外，國內(nèi)FCM設(shè)備和試劑主要依靠進(jìn)口，導(dǎo)致我國FCM的臨床應(yīng)用相對緩慢。然而，近年來，國內(nèi)流式行業(yè)已經(jīng)推出了民族品牌并獲得了臨床認(rèn)可。FCM與大數(shù)據(jù)和個性化醫(yī)療的需求高度兼容，必將為人類健康提供更準(zhǔn)確的服務(wù)。

綜上所述，我國的FCM在臨床和科學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，并且在儀器儀表和技術(shù)上取得了一些進(jìn)展，但也應(yīng)該明確認(rèn)識到，F(xiàn)CM的技術(shù)發(fā)展和臨床應(yīng)用仍需改進(jìn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Otto O，Rosendahl P，Mietke A，et al.Real-time deformability cytometry：on-the-fly cell mechanical phenotyping[J].Nat Methods，2015，12（3）：199-202.

[2]Galanzha EI，Viegas MG，Malinsky TI，et al.In vivo acoustic and photoacoustic focusing of circulating cells[J].Sci Rep，2016，6（2）：66-74.

[3]Gossett DR，Weaver WM，Mach AJ，et al.Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems[J].Anal Bioanal Chem，2010，397（8）：3249-3267.

[4]中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會，衛(wèi)生部臨床檢驗中心，中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志編輯委員會.流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用的建議[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（12）：1064-1073.

[5]Saeys Y，Gassen SV，Lambrecht BN.Computational flow cytometry：helping to make sense of high-dimensional immunology data[J].Nat Rev Immunol，2016，16（7）：449-462.

[6]Pospichalova V，Svoboda J，Dave Z，et al.Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer[J].J Extracell Vesicles，2015，23（4）：25 530-25 535.

[7]Kondo T，Setoguchi T，Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA，2018，101（3）：781-786.

[8]Mejstrkova E，F(xiàn)ronkovd E，Kalina T，et al.Detection of residual B precursor lymphoblastic leukemia by uniform gating flow cytometry[J].Pediatr Blood Cancer，2010，54（1）：62-70.

[9]沈立松，王維維，袁向亮.我國臨床流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀和展望[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，39（5）：329-331.

[10]權(quán)文強，李冬.流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，39（5）：336-339.

[11]Edwards BS，Sklar LA.Flow cytometry：impact on early drug discovery[J].J Biomol Screen，2015，20（6）：689-707.

[12]Robinson JP，Roederer M.History of science.Flow cytometry strikes gold[J].Science，2015，350（2）：739-740.

[13]Fulwyler MJ.Electronic separation of biological cells by volume[J].Science，1965，150（3）：910-911.

[14]Goddard G，Martin JC，Graves SW，et al.Ultrasonic particle-concentration for sheathless focusing of particles for analysis in a flow cytometer[J].Cytometry A，2006，69（2）：66-74.

[15]Papakonstantinou S，Berzina I，Lawlor A，et al.Rapid，effective and user-friendly immunophenotyping of canine lymphoma using a personal flow cytometer[J].Ir Vet J，2013， 66（1）：6-9.

[16]Jovin TM.Quantum dots finally come of age[J].Nat Biotechnol，2003，21（1）：32-33.

[17]Nolan JP，Condello D.Spectral flow cytometry[J].Curr Protoc Cytom，2013，34（2）：66-74.

[18]Shalapour S，F(xiàn)ont-Burgada J，Di G，et al.Immunosuppressive plasma cells impede T-cell-dependent immunogenic chemotherapy[J].Nature，2015，521（5）：94-98.

[19]Garcia-Foncillas J，Alba E，Aranda E，et al.Incorporating beaming technology as a liquid biopsy into clinical practice for the management of colorectal cancer patients：an expert taskforce review[J].Ann Oncol，2017，132（3）：321-327.

[20]Bendall SC，Nolan GP.From single cells to deep phenotypes in cancer[J].Nat Biotechnol，2012，30（7）：639-647.

[21]Fang D，Nguyen TK，Leishear K，et al.A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas[J].Cancer Res，2018，65（20）：9328-9337.

[22]王維維，奚迪，袁向亮，等.不同流式細(xì)胞分析儀檢測淋巴細(xì)胞亞群的比較研究[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，39（5）：361-365.

[23]Basiji DA.Principles of amnis imaging flow cytometry[J].Methods Mol Biol，2016，1389（3）：13-21.

[24]Piyasena ME，Graves SW.The intersection of flow cytometry with microfluidics and microfabrication[J].Lab Chip，2014， 14（6）：1044-1059.

[25]Issadore D，Chung J，Shao H，et al.Ultrasensitive clinical enumeration of rare cells ex vivo using a micro-hall detector[J].Sci Transl Med，2012，4（11）：141-145.

[26]Lim SW，Abate AR.Ultrahigh-throughput sorting of microfluidic drops with flow cytometry[J].Lab Chip，2013，13（12）：4563-4572.

[27]Watanabe M，Uehara Y，Yamashita N，et al.Multicolor detection of rare tumor cells in blood using a novel flow cytometry-based system[J].Cytometry A，2014，85（3）：206-213.

[28]劉志勇，李寶江.乳腺癌新輔助化療中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的動態(tài)變化及療效觀察[J].中國腫瘤臨床，2013，40（23）：1431-1435.

[29]Lu Y，Liang H，Yu T，et al.Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry[J].Cancer，2015，121（17）：3036-3045.

[30]Sugihara E，Saya H.Complexity of cancer stem cells[J].Int J Cancer，2012，132（6）：1249-1259.

（收稿日期：2019-04-15 ?本文編輯：孟慶卿）