汪 洋，嚴(yán)茂林，陳和平

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072；2電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610051)

胰腺為腹膜后臟器，是人體重要的消化器官，分為內(nèi)分泌腺和外分泌腺兩部分，糜蛋白酶C(CTRC)主要涉及外分泌功能。胰腺疾病包括胰腺炎癥和胰腺腫瘤等，胰腺炎癥大體分為急性胰腺炎(AP)和慢性胰腺炎(CP)，急性復(fù)發(fā)性胰腺炎(RAP)可以轉(zhuǎn)變?yōu)槁砸认傺?，由慢性胰腺炎到胰腺上皮?nèi)瘤(PanIN)變最后到胰腺癌(PC)是一個(gè)漸變過程。CTRC基因是新近發(fā)現(xiàn)的CP易感基因，其突變可增加CP患病風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)加重RAP發(fā)展到CP的病程[1]。此外，更好地了解病因因素與易感SNP的相互作用將有助于在早期階段診斷和治療該疾病。目前迫切需要利用基因組學(xué)上的進(jìn)步，即GWAS和/或外顯子組測序在NGS平臺(tái)上解開尚未確定的胰腺炎易感性位點(diǎn)。CTRC基因突變可能導(dǎo)致PC的發(fā)生[2]，目前尚需更多的來自不同地區(qū)的實(shí)驗(yàn)來探討PC中存在的CTRC基因突變；CTRC在PC低表達(dá)，并與PC侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，了解CTRC在胰腺癌前病變與癌癥之間表達(dá)差異可以進(jìn)一步預(yù)測該蛋白能否作為診斷標(biāo)記物。本文對(duì)胰腺疾病中CTRC基因變異的研究進(jìn)展做一綜述。

1 CTRC結(jié)構(gòu)、功能及基因定位

CTRC由252個(gè)氨基酸組成，包含5對(duì)二硫鍵和絲氨酸/組氨酸及天冬氨酸組成的催化中心。其編碼基因(OMIM*601405)位于染色體1p36.21上，包含8個(gè)外顯子，長度8.2 kb。人類CTRC基因位于ELA2A和ELA2B基因附近，CTRC和ELA2A之間的序列同源程度高于CTRC和CTRB1或CTRB2之間的序列同源程度。

CTRC基因編碼胰凝乳蛋白酶C，一種消化酶。它是由胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)管細(xì)胞分泌的蛋白酶原，與酶原顆粒一起包裝，并與胰腺中的其他消化酶一起分泌。CTRC在十二指腸被胰蛋白酶激活?；罨蟮腃TRC具有很多生理功能：①促進(jìn)胰蛋白酶原的自動(dòng)激活：CTRC切割胰蛋白酶原的第18位苯丙氨酸和19位門冬氨酸結(jié)合處的肽鍵以及N端的三肽，從而清除胰蛋白酶原及其活化肽之間的靜電作用，進(jìn)一步促進(jìn)胰蛋白酶原的自動(dòng)激活。②促進(jìn)胰蛋白酶/酶原的降解：通過切割胰蛋白酶原鈣結(jié)合環(huán)內(nèi)的第81位亮氨酸和82位谷氨酸之間的肽鍵，來促進(jìn)胰蛋白酶/酶原的降解。兩者降解的差異主要在CTRC能更快地切割陽離子胰蛋白酶原的Leu81-Glu82肽鍵，在陽離子胰蛋白酶原的Leu81-Glu82鍵斷裂后，CTRC進(jìn)一步以緩慢速率消化Leu41-Asn42肽鍵。CTRC在高位腸道促進(jìn)酶原的激活，在低位腸道促進(jìn)酶原的降解。腸內(nèi)高鈣環(huán)境會(huì)封閉鈣結(jié)合環(huán)內(nèi)的切割位點(diǎn)，使得胰蛋白酶原的降解作用是弱的，胰腺分泌的鈣濃度是極微量的(以亞豪克為單位)，故CTRC占優(yōu)勢的功能是降解，保護(hù)胰腺內(nèi)胰蛋白酶原不能提前激活。③輔助活化羧肽酶A1和A2：CTRC通過使前肽的α-螺旋連接片段蛋白水解而發(fā)揮作用，前肽解離并完全降解，使羧肽酶具有完全的活性。CTRC在多個(gè)位點(diǎn)切割前肽中的連接區(qū)段，但多保守在Leu96-Leu97肽鍵。

2 CTRC基因與AP

關(guān)于AP中CTRC基因的研究方向，目前主要在研究基因突變和基因多態(tài)性兩方面。RAP的發(fā)生可能與CTRC基因突變相關(guān)，尤其是在RAP向發(fā)展CP的過程。Werlin等分析67例ARP患者發(fā)現(xiàn)其中有三分之一患有遺傳性胰腺炎的突變，包括罕見突變(K23R)，強(qiáng)調(diào)了RAP患者可能主要通過遺傳學(xué)導(dǎo)致疾病的發(fā)生[3]。對(duì)于CTRC基因多態(tài)性的研究多為關(guān)于SNP位點(diǎn)c.180C> T的分析，Koziel 等收集分析99例波蘭凱爾采地區(qū)AP樣本CTRC多態(tài)性c.180C> T與AP發(fā)病及臨床過程的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)雜合c.180C> T位點(diǎn)改變會(huì)增加AP發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[4]，后分析221例AP患者發(fā)現(xiàn)病例組與對(duì)照組的CTRC突變(p.I259 V，p.V235I，p.K247R254del，p.E225 A)頻率沒有顯著差異[5]。LaRusch等也發(fā)現(xiàn)此常見CTRC基因位點(diǎn)變異c.180 C > T可作為促進(jìn)RAP進(jìn)展至CP的疾病調(diào)節(jié)劑，尤其合并CFTR基因變異，SPINK1基因變異，酗酒或吸煙患者可加重病程[1]。另有研究發(fā)現(xiàn)，伴有CTRC基因突變的脂蛋白酶缺乏的AP患者，其疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加[6]。

在兒童特發(fā)性ARP和CP，遺傳分析對(duì)于確定胰腺炎的病因有一定臨床價(jià)值[7]。Giefer等對(duì)342兒童急性胰腺炎患者研究發(fā)現(xiàn)，胰腺炎的發(fā)病年齡早與 CTRC突變密切相關(guān)，發(fā)病年齡較晚的兒童更可能由于非遺傳性危險(xiǎn)因素而致病[8]。目前主要發(fā)現(xiàn)CTRC位點(diǎn)c.180C> T的變異與AP相關(guān)，尚需進(jìn)一步研究其他CTRC位點(diǎn)改變是否與AP相關(guān)聯(lián)，尤其對(duì)于遺傳學(xué)有極大影響的兒童隊(duì)列而言。

3 CTRC基因與CP

CP是多種因素導(dǎo)致的胰腺進(jìn)行性不可逆炎性疾病，其病理特征包括腺泡細(xì)胞萎縮壞死，間質(zhì)纖維化及鈣化。臨床特征包括慢性腹痛，腹瀉，嘔吐，消化不良和糖尿病[9]。既往研究表明，疾病的發(fā)生與遺傳學(xué)因素有關(guān)[10]。危險(xiǎn)性遺傳因素與保護(hù)性遺傳因素之間的平衡決定了CP易感性。過早活化的胰蛋白酶被CTRC通過作用于無鈣的鈣結(jié)合環(huán)內(nèi)的分子而被破壞，因此CTRC可做胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵候選基因。Paliwal等對(duì)621例特發(fā)性或遺傳性CP和614名德國對(duì)照者的CTRC基因全部8個(gè)外顯子(8.2 kb)進(jìn)行測序，確定大部分變異在第2，第3和第7外顯子。后對(duì)280例CP患者外顯子2，3和7測序，發(fā)現(xiàn)了許多錯(cuò)義和缺失突變。在胰腺炎組中兩種最常見基因改變是c.760C> T(p.R254W)和c.738761del24(p.K247R254del)，兩者均位于外顯子7。此外，該研究組還研究了71例印度熱帶胰腺炎患者，提示該人群CTRC基因改變的頻率較高，與德國隊(duì)列相比，在印度隊(duì)列中最常見的兩種基因改變?yōu)閏.217 g> A(p.A73T)錯(cuò)義改變和c.190193del ATTG(p.I64LfsX69)移碼缺失。有研究表明與印度CP顯著相關(guān)的變異位點(diǎn)為p.A73T和c.180C> T[11]。上述研究均表明CTRC基因突變譜在歐美與亞洲國家有差異，另有研究表明在亞洲不同國家之間其突變譜與致病性也不一致。Sun-Mi Cho等在116例韓國CP隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)突變p.P249L，雖然這一突變?cè)谙惹皻W洲研究中是致病性的，但在此特發(fā)性胰腺炎隊(duì)列中不起作用[12]。Masamune等[13]在日本CP患者中發(fā)現(xiàn)了5種新的錯(cuò)義突變(8/506)。然而，只有三種變異，包括p.R29Q，p.S239C和p.R254W，在功能上被證明是有害的[14，15]。我國對(duì)于CTRC基因突變研究較少，僅臺(tái)灣地區(qū)分析報(bào)道了126例成人CP患者中CTRC基因突變頻繁的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括c.673 g>A等在內(nèi)的10個(gè)先前未發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)改變[16]。除此之外，有兩項(xiàng)關(guān)于兒童CP的研究，一項(xiàng)中國兒科ICP患者的隊(duì)列研究沒有發(fā)現(xiàn)任何CTRC的致病突變[17]；另一項(xiàng)上海的研究在兒童CP中僅發(fā)現(xiàn)一例突變[18]。

CTRC基因突變導(dǎo)致的功能效應(yīng)是CP可能的發(fā)病機(jī)制，這些功能效應(yīng)主要包括四個(gè)方面：①分泌受損：Derikx等報(bào)道轉(zhuǎn)染突變p.G61R的HEK 293 T細(xì)胞中CTRC的分泌是不可測量的[19]。在用重組腺病毒轉(zhuǎn)染的AR42 J大鼠腺泡細(xì)胞系中觀察到由p.A73T突變引起的分泌缺陷[20]。移植突變p.I64LfsX69和p.G103 VfsX31以及無義突變p.W55X也預(yù)期會(huì)導(dǎo)致CTRC分泌的完全喪失，但缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證明；②催化活性下降：Chee等研究發(fā)現(xiàn)具有p.K247R254del和p.G217 S突變的CTRC無催化活性，而具有p.Q48R和p.A73T突變的CTRC酶活性降低[21]；③被胰蛋白酶降解：突變體p.G217R，p.G217 S和p.K247R254del在低胰蛋白酶/CTRC比率條件下幾乎完全降解[14]；④增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的傾向：CTRC突變可誘導(dǎo)蛋白的錯(cuò)誤折疊，引起ER應(yīng)激，激活炎癥轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)，隨后腺泡細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致CP。ER應(yīng)激相關(guān)的CTRC突變通過SIRT2介導(dǎo)的微管失調(diào)減少胰腺酶原分泌[22]。

4 CTRC基因與胰腺上皮內(nèi)瘤變

胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanIN)是一種顯微鏡下的扁平或乳頭狀非侵襲性病變，主要發(fā)生在直徑小于10 mm的小胰管，內(nèi)襯一定程度異性的柱狀或立方細(xì)胞。根據(jù)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核異性程度可以將PanIN分為PanIN-1，PanIN-2和PanIN-3三個(gè)等級(jí)，其中PanIN-1可以進(jìn)一步分為PanIN-1A和PanIN-1B。PanIN是胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)最常見的前體病變，可經(jīng)過多個(gè)階段的組織學(xué)和遺傳學(xué)改變進(jìn)展至PDAC。在遺傳學(xué)方面，PanIN和PDAC存在多種相同的分子改變，包括K-ras基因激活突變，Smad4表達(dá)缺失，c-erbB-2基因過表達(dá)等。Buchholz等研究基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)的最大變化發(fā)生在PanIN分期1B和2之間，表明PanIN-2可能代表PDAC進(jìn)展中的第一個(gè)真正的腫瘤前期階段[23]。此研究還發(fā)現(xiàn)與正常胰腺組織相比，CTRC基因在PanIN表達(dá)顯著增高，尤其在PanIN-2，此外PanIN與胰腺導(dǎo)管腺癌相比，CTRC基因表達(dá)亦有顯著差異，提示CTRC可能標(biāo)記PanIN的重要性。目前尚缺乏胰腺癌前病變與CTRC基因相關(guān)性的研究，需要更多的實(shí)驗(yàn)探討兩者之間可能的聯(lián)系，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)前的發(fā)現(xiàn)。

5 CTRC基因與胰腺癌

胰腺癌惡性程度極高，預(yù)后差，5年生存率不足7%[24]。在美國消化道腫瘤相關(guān)死亡率中排第四名。據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，僅9%的患者在腫瘤早期或局限期被診斷胰腺癌，5年生存率約為25%，而約53%的患者在確診時(shí)已處于腫瘤晚期，5年生存率僅2%[25]。CTRC基因突變可能導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生。有研究表明，伴有CTRC基因突變的慢性胰腺炎患者，患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)將增加。波蘭一項(xiàng)納入16例胰腺癌患者的研究CTRC多態(tài)性p.G60 =(c.180C>T)在胰腺癌患者中頻繁出現(xiàn)[2]。目前發(fā)現(xiàn)CTRC基因多態(tài)性c.180C>T改變廣泛存在CP及PC中，是否提示伴有此多態(tài)性位點(diǎn)改變的患者會(huì)影響CP向PC進(jìn)展。與上述研究不同的是，對(duì)德國121例PC患者研究發(fā)現(xiàn)CTRC基因突變似乎不顯著增加胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[26]。在CTRC基因拷貝數(shù)變異上肉瘤改變最為顯著，其次未淋巴瘤，而胰腺癌無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明PC中CTRC基因改變主要在于基因突變和基因多態(tài)性改變，而非基因拷貝數(shù)變異?？紤]到CTRC在PanIN與PC中的差異表達(dá)，是否可以在癌癥早期階段通過檢測組織或分泌到血液中CTRC的表達(dá)來達(dá)到早診斷。早治療的目的。目前尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討在胰腺癌與癌前病變之間CTRC基因改變與表達(dá)的差異，并明確血液中CTRC在兩種疾病間的表達(dá)差異趨勢是否與組織上一致。

綜上所述，CTRC基因改變?cè)诙喾N胰腺疾病中被發(fā)現(xiàn)，并參與胰腺疾病的進(jìn)展過程。隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)于胰腺疾病與CTRC基因的相關(guān)性理解得到了很大的提高。應(yīng)建立理想的動(dòng)物模型，找到關(guān)鍵的發(fā)病機(jī)制，并將其應(yīng)用于臨床，為急慢性胰腺炎的治療提供新的思路。同時(shí)后續(xù)需要大量深入研究來探討CTRC基因突變?cè)谝认侔┲械墓δ苄?yīng)，以及CTRC與胰腺癌相關(guān)表型的相關(guān)性，為PC的診斷和防治提供新的策略。