李娜，賈俊香，楊國棟，姜濱濱，蔣欣陶，田云，張艷玲，崔連偉

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧沈陽110161）

大蔥是植物分類學(xué)上的蔥科植物。大蔥營養(yǎng)豐富，富含維生素、微量元素和氨基酸，深受人們喜愛。近年來對大蔥的研究日趨深入和廣泛，特別是大蔥的組織培養(yǎng)技術(shù)正逐步走向成熟化和工業(yè)化。目前大蔥離體培養(yǎng)大部分以花蕾作為外植體[1]，也有以子葉[2]、根[3]、成熟胚[4]等作為外植體取得成功的報道。該文通過對大蔥花序軸的培養(yǎng)，從中篩選出大蔥花序軸誘導(dǎo)、分化、繼代和生根培養(yǎng)較適合的培養(yǎng)基，為大蔥工廠化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年3月選取遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所的大蔥試材Q278為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體的取樣及消毒。選取未開放的大蔥花球，切去花球下部的花莖，用自來水沖洗30~40 m in。在超凈工作臺上首先用75%的酒精進(jìn)行表面消毒30 s，再用0.1%的氯化汞消毒9 m in，無菌水清洗3~5次，最后用無菌濾紙吸干表面水分，將花序軸底部切去，然后按“十字”形切成4塊待用。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)。采用不同濃度的6-BA（1.0、3.0、5.0、7.0 mg/L）和NAA（0.01、0.1 mg/L）組合配成8種MS培養(yǎng)基，將消毒后經(jīng)過處理的外植體接種到這8種培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。每種處理接種6瓶，每瓶4個外植體，接種30 d后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率。

1.2.3 愈傷組織的分化。采用不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.01、0.1 mg/L）組合配成8種MS培養(yǎng)基。將愈傷組織接種到這8種培養(yǎng)基中，進(jìn)行分化培養(yǎng)。每種處理接種3瓶，每瓶4個不定芽塊。接種30 d后統(tǒng)計分化率。

1.2.4 不定芽塊的繼代培養(yǎng)。采用不同濃度的6-BA（0.2、0.4、0.8 mg/L）和NAA（0.2、0.4 mg/L）組合配成6種MS培養(yǎng)基。將一定數(shù)量的不定芽塊接種到這6種培養(yǎng)基中，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每種處理接種6瓶，每瓶4個不定芽塊。接種30 d后統(tǒng)計分化率。

1.2.5 生根培養(yǎng)。采用不同濃度的IAA（0.05、0.1、0.2 mg/L）配成3種MS培養(yǎng)基，利用不同濃度的NAA（0.05、0.1、0.2 mg/L）配成3種MS培養(yǎng)基。將一定數(shù)量的蔥苗接種到這6種培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。每種處理接種6瓶，每瓶4個蔥苗。接種30 d后統(tǒng)計生根率。

1.2.6 培養(yǎng)條件。在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照16 h/d，光強(qiáng)2 500 lx。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同濃度6-BA和NAA對外植體愈傷組織的誘導(dǎo)

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)40~50 d后，觀察生長情況，統(tǒng)計誘導(dǎo)出愈傷組織的數(shù)量，并計算愈傷誘導(dǎo)率。從表1可以看出，愈傷的誘導(dǎo)明顯受到NAA的影響，當(dāng)NAA為0.1 mg/L時，不同濃度的6-BA的平均誘導(dǎo)率為36.5%；NAA 0.01 mg/L時，不同濃度的6-BA的平均誘導(dǎo)率為63.8%，說明濃度低的NAA利于愈傷誘導(dǎo)。綜合結(jié)果認(rèn)為MS+BA 7.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基較為適宜。

2.2 不同濃度6-BA和NAA對愈傷組織分化的影響

誘導(dǎo)出的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，觀察生長情況，統(tǒng)計分化出的不定芽數(shù)量，計算不定芽分化率。從表2可以看出，愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基后分化迅速，10 d后觀察愈傷組織分化出大量的不定芽，20 d后又有新的不定芽長出。研究結(jié)果表明，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L增殖系數(shù)最高為5.0，無玻璃化現(xiàn)象，最適合愈傷組織分化。當(dāng)6-BA、NAA濃度增加時，增殖系數(shù)降低，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，玻璃化率達(dá)15%。

2.2 不同濃度6-BA和NAA對不定芽增殖的影響

分化出的芽在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，觀察生長情況，統(tǒng)計分化出的不定芽數(shù)量，計算芽增殖率。從表3可以看出，當(dāng)基本培養(yǎng)基為MS時，6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L和6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.4 mg/L增殖系數(shù)最高為3.0，但6-BA0.2mg/L+NAA0.4 mg/L玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，不適宜。當(dāng)6-BA、NAA濃度增加時，增殖系數(shù)降低。因此，MS+6-BA0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最適繼代培養(yǎng)基。

2.3 不同濃度NAA和IAA對生根和移栽的影響

從不定芽塊上切取蔥苗接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后，觀察蔥苗生長情況，并統(tǒng)計蔥苗生根情況，計算生根百分率、平均每株根數(shù)、平均每株根長等。生根后的蔥苗移栽時，首先打開封口膜，往培養(yǎng)瓶中注入蒸餾水，以不淹沒小苗為標(biāo)準(zhǔn)。一般煉苗3~5 d，期間缺水時及時補(bǔ)水。取苗時，用鑷子將蔥苗取出，并清洗蔥根部的培養(yǎng)基，移入草炭∶珍珠巖=1∶1（V/V）的基質(zhì)中，放入相對濕度80%~90%、溫度15~24℃的人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，移栽30 d后確定成活率。

從表4可以看出，在不同濃度的NAA或IAA的MS培養(yǎng)基上，蔥苗生根率除0.1 mg/L NAA為92.3%以外，都為100%。說明附加NAA或IAA 0.05~0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基對大蔥苗的生根都有促進(jìn)作用，其中添加0.05 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上的蔥苗的生根數(shù)達(dá)到7.5，平均每株根長7.16 mm。但0.05 mg/L NAA的苗比較細(xì)弱、發(fā)黃，移栽成活率低于70%，添加IAA 0.2 mg/L平均每株根長4.5 mm，粗壯，可認(rèn)為提高IAA濃度利于蔥苗的成活。結(jié)果表明，IAA濃度為0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基利于蔥苗生根培養(yǎng)，是蔥苗生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

表1 不同激素組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 不同濃度6-BA和NAA對愈傷組織分化的影響

表3不同濃度6-BA和NAA對不定芽繼代的影響

表4 不同激素濃度對蔥苗生根的影響

3 討論

在大蔥花序軸誘導(dǎo)階段，增殖系數(shù)隨6-BA濃度的升高而增高，隨NAA濃度的升高而降低，但在分化、繼代培養(yǎng)基上，低濃度的6-BA、NAA利于芽的增殖，由于未設(shè)計更低濃度，需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。綜上，以大蔥花序軸為外植體，獲得了較高的增殖系數(shù)、生根率和移栽成活率，建立了高效的大蔥離體再生體系，為大蔥品種更新提供了一個基礎(chǔ)平臺。