張文婧，婁曉鳴，朱旭東，金立敏

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州215008）

植物組織培養(yǎng)技術(shù)自20世紀(jì)60年代開始已逐漸走向工廠化和商品化階段，現(xiàn)在植物組織培養(yǎng)已經(jīng)變成一種常規(guī)試驗技術(shù)，廣泛應(yīng)用于植物的脫毒、快繁、基因工程、細(xì)胞工程、遺傳研究、次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)、工廠化育苗等多個方面，幾乎每天都有可能出現(xiàn)利用新的植物種類獲得培養(yǎng)成功的報道。貝母屬植物在中國主要研究應(yīng)用集中在藥用價值方面，利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)可以克服其在種子繁殖和鱗莖繁殖技術(shù)上的不足，大大提高觀賞貝母繁殖的速度，是實現(xiàn)觀賞貝母產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。其中藥用貝母組織培養(yǎng)快繁技術(shù)方面的研究很多，但觀賞貝母的組織培養(yǎng)技術(shù)相對較少，目前僅有湯甜等[12]在3種貝母的快繁及離體保存技術(shù)研究中做了比較具體的探究。該研究以3種觀賞貝母的鱗片為外植體，探討了不同品種的出芽率、增殖率、生根情況及煉苗成活生長情況，為觀賞貝母組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料選擇從荷蘭C B TC國際園藝有限公司進(jìn)口，未經(jīng)栽種過的無病害、無明顯外傷的健康種球鱗片作為外植體材料，供試品種為冠花貝母（F.imperialis‘Rubra Maxima’）、紫花貝母（F.uva-vulpis）和彎尖貝母（F.acmopetala）；試驗耗材為MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂粉、75%酒精、10%次氯酸鈉、0.1%H g C l2、BA、NAA。

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇及消毒。冠花貝母‘魯布拉’剝?nèi)△[莖中內(nèi)層（2層以內(nèi)）無病無機(jī)械損傷鱗片的中下部，紫花貝母和彎尖貝母由于種球較小，所以選擇整個鱗莖作為外植體。外植體用洗滌劑洗凈后置于流水下沖洗30 m in，沖洗完成后在無菌操作臺用75%酒精浸泡30 s，10%次氯酸鈉溶液浸泡25 m in，浸泡完成后用無菌水沖洗3~5次，置于無菌濾紙上吸干多余水分備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的選擇及處理。查閱文獻(xiàn)，制定外植體誘導(dǎo)、繼代和生根培養(yǎng)基配方（表1）[12]。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基均用MS固體培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA和NAA，加瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L，p H 5.8，培養(yǎng)溫度25±1℃，光照時間12 h/d，光照強(qiáng)度2 500 lx；生根結(jié)球培養(yǎng)基選用1/2固體培養(yǎng)基，為促進(jìn)鱗莖球的形成，蔗糖濃度提高到60 g/L，先暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)為2 500 lx，12 h/d光培養(yǎng)。

表1 觀賞貝母組織培養(yǎng)快繁體系培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)，將消毒后的鱗莖切割成0.8 c m左右見方的小塊，以背面朝下接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，接種后每5 d觀察1次生長情況，20 d后統(tǒng)計3個品種觀賞貝母的污染率、死亡率，35 d后統(tǒng)計各品種外植體的分化情況；增殖培養(yǎng)，當(dāng)誘導(dǎo)芽長至1~2 c m時轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基，接種后每5 d觀察1次增殖情況，25 d后統(tǒng)計增殖率；繼代培養(yǎng)，35~40 d后可繼續(xù)轉(zhuǎn)接進(jìn)行下一輪增殖培養(yǎng)或轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根結(jié)球培養(yǎng)；生根培養(yǎng)，將健壯的增殖苗轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基，先暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)為2 500 lx，12 h/d光培養(yǎng)，生根結(jié)球培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根、結(jié)球情況；煉苗移栽，挑選生長情況良好的生根苗在20~25℃、相對濕度85%的環(huán)境中進(jìn)行煉苗移栽，煉苗基質(zhì)為草炭∶礱糠灰∶珍珠巖7∶2∶1，煉苗90 d后統(tǒng)計各品種成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的誘導(dǎo)與分化

從表2可以看出，在同一種消毒方法下，3種觀賞貝母的污染率、死亡率不同，效果最好的是彎尖貝母，總體成活率可達(dá)90%，其次為紫花貝母，這和2個品種本身鱗莖較小、鱗莖包裹緊實、內(nèi)部比較干凈有一定關(guān)系。冠花貝母‘魯布拉’鱗莖較大，內(nèi)部中空，外界污染物極易侵入，難以消毒徹底，因此初代培養(yǎng)污染率與其他2個品種相比較高。

從表3可以看出，3種觀賞貝母在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中均能較好地進(jìn)行分化，外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基1周后，鱗片逐漸轉(zhuǎn)綠并陸續(xù)發(fā)生分化，30 d左右可見出芽。試驗中發(fā)現(xiàn)冠花貝母鱗莖多為不形成愈傷組織直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，在鱗片腹面直接分化出小突起，小突起2周左右可繼續(xù)分化為葉的不定芽，部分前期形成愈傷組織后期也會玻璃化，無法誘導(dǎo)出不定芽；而彎尖貝母和紫花貝母鱗莖則多在外植體腹面近切口處或于切口處先形成不規(guī)則的黃綠色或綠色愈傷組織，再分化出乳白至嫩黃色半透明或不透明的不定芽，分化率和出苗率都比較高，能夠產(chǎn)生大量不定芽且出芽整齊。

表2 不同品種污染率比較

表3 不同品種外植體的分化情況

2.2 繼代增殖與生根培養(yǎng)

從誘導(dǎo)培養(yǎng)的結(jié)果可以看出，冠花貝母多從鱗莖直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，而彎尖貝母和紫花貝母則為先誘導(dǎo)愈傷組織，因此從誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)2周后，冠花貝母從苗基部生出新的增殖苗，彎尖貝母和紫花貝母由愈傷組織再分化出不定芽。從表4可以看出，3個品種觀賞貝母繼代培養(yǎng)40 d時，彎尖貝母增殖情況最好，污染率低，且增殖芽生長健康，葉色濃綠；其次為紫花貝母，生長情況良好；增殖率最低的是冠花貝母，由于多為直接誘導(dǎo)的不定芽，所以增殖系數(shù)僅為2.07，試驗中還發(fā)現(xiàn)冠花貝母部分幼苗出現(xiàn)了不同程度的畸形、玻璃化現(xiàn)象。

組培苗在繼代培養(yǎng)過程中，已有個別苗出現(xiàn)生根現(xiàn)象，但是根數(shù)很少，生根培養(yǎng)20 d左右可生出白色或淡綠色的根。從圖1中可以看出，彎尖貝母、紫花貝母在1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L、蔗糖濃度60 g/L的生根培養(yǎng)基中生根效果良好，根量多，發(fā)根整齊，基部小鱗莖膨大明顯，苗健壯；冠花貝母在同樣培養(yǎng)條件下也能正常生根，生根率高，但小苗抽葉少，幾乎無小鱗莖膨大，對后期移栽煉苗帶來困難。

表4 不同品種增殖情況

圖1 3個品種繁殖率對比

圖2 3個品種煉苗成活率

2.3 組培苗的移栽

在上一階段培養(yǎng)得到的生根苗新根長到1~2 c m時，開瓶在自然環(huán)境中適應(yīng)5~7 d，取出洗凈根系上附著的培養(yǎng)基等物質(zhì)，移入消毒后的草炭∶礱糠灰∶珍珠巖7∶2∶1基質(zhì)中，保持85%的濕度，50~60%自然光照，每日噴灑2次水，20 d左右噴1次稀釋MS營養(yǎng)液，觀察其生長情況。從圖2可以看出，彎尖貝母、紫花貝母成活率高，生長良好，尤其是彎尖貝母煉苗成活率高達(dá)100%，冠花貝母成活率偏低，極易死亡，這與其移栽小苗根部沒有新生鱗莖球有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

試驗表明，75%酒精30 s+10%次氯酸鈉25 m in對3種觀賞貝母的消毒效果較好，冠花貝母由于鱗莖較大，易產(chǎn)生內(nèi)生菌，污染率較高。在同樣的培養(yǎng)環(huán)境中，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，完成初代誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L增殖培養(yǎng)基后，發(fā)現(xiàn)彎尖貝母、紫花貝母先形成不規(guī)則的黃綠色或綠色愈傷組織，再分化出乳白至嫩黃色半透明或不透明的不定芽，分化率和出苗率高，且出芽整齊，生長良好。

觀賞貝母作為球根花卉，其生根過程中是否有小鱗莖產(chǎn)生，是組培產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要部分，具有小鱗莖的組培苗移栽成活率高。在生根培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)增加蔗糖濃度可以提高結(jié)球率，但濃度過高會抑制新葉的生長，因此該試驗中蔗糖濃度設(shè)定為60 g/L，同時結(jié)合2周的暗培養(yǎng)來促進(jìn)觀賞貝母鱗莖球的產(chǎn)生。從試驗結(jié)果可知，彎尖貝母、紫花貝母在此培養(yǎng)基中生根率高，能很好地形成小鱗莖且植株生長健壯，后期移栽煉苗成活率高；冠花貝母雖然生根率高，但很難直接誘導(dǎo)出小鱗莖，在培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生內(nèi)生菌和玻璃化現(xiàn)象，因此后期移栽煉苗成活率也很低，生長情況不佳。

通過試驗可得出，紫花貝母、彎尖貝母這2個品種可運(yùn)用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)擴(kuò)大數(shù)量進(jìn)行推廣，并進(jìn)一步研究冠花貝母小鱗莖形成技術(shù)，以提高冠花貝母的繁殖速度。利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)可在短時間內(nèi)獲得大量種苗，對于幫助解決觀賞貝母市場種球價格昂貴、常規(guī)繁殖率低等問題具有一定的意義。