藏旭陽(yáng)，代培紅，李繼洋，蒲艷，顧愛(ài)星，劉曉東

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052）

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物、紡織工業(yè)原料和國(guó)家戰(zhàn)略物資，其相關(guān)產(chǎn)業(yè)是國(guó)民經(jīng)濟(jì)體系的重要組成部分。解放后我國(guó)棉花種植業(yè)經(jīng)歷了幾十年的蓬勃成長(zhǎng)，棉花的總產(chǎn)量及單位面積產(chǎn)量得到了成倍的增長(zhǎng)。然而棉花生產(chǎn)依然面臨很多問(wèn)題，如新疆土地鹽堿嚴(yán)重，干旱缺水，導(dǎo)致大量土地不能充分利用[1]，另外干旱和鹽堿脅迫也影響棉花農(nóng)藝形狀、產(chǎn)量和品質(zhì)等[2]；棉花枯、黃萎病大面積發(fā)生，對(duì)棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[3-4]。棉花品質(zhì)低、成本高，導(dǎo)致棉花大量積壓、植棉效益低下。為解決這些問(wèn)題就需要培育出抗病抗逆優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的棉花新品種，而創(chuàng)制出這些新品種最終需要棉花生物學(xué)創(chuàng)新作為理論基礎(chǔ)，需要棉花功能基因組學(xué)來(lái)解析農(nóng)藝性狀調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)[5-6]。但是廣泛種植的棉花是異源四倍體，其基因組大而復(fù)雜，棉花基因功能的研究存在巨大困難。而基因組編輯技術(shù)的誕生則為棉花基因功能的研究和棉花農(nóng)藝性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析提供了強(qiáng)大的技術(shù)解決工具。不僅如此，基因組編輯技術(shù)還可以用來(lái)創(chuàng)造出更多優(yōu)異的棉花育種材料[7-8]。

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是 三大主 要基因組編輯技術(shù)，其中CRISPR/Cas9技術(shù)簡(jiǎn)單、高效、靈活、方便等優(yōu)點(diǎn)而為廣大科研工作者所接受[9]。U3或U6啟動(dòng)子具有明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的重要元件。目前前人已利用植物自身的U3或U6啟動(dòng)子，在擬南芥、玉米、棉花、水稻、煙草、大豆等物種中成功建立了CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系[10-14]。金雙俠等[15]建立的啟動(dòng)子誘捕系統(tǒng)中的GUS基因高頻率、多模式和時(shí)空特異性表達(dá)為分離基因及其調(diào)節(jié)序列、開(kāi)展功能基因組研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

雷建峰等[16-18]從海島棉品種新海16中克隆了2個(gè)GbU3啟動(dòng)子、5個(gè)GbU6啟動(dòng)子，并驗(yàn)證它們?cè)诿藁ㄖ芯哂修D(zhuǎn)錄活性，但是這些啟動(dòng)子能否在CRISPR/Cas9體系中實(shí)現(xiàn)對(duì)棉花內(nèi)源基因的編輯功能，目前還不很清楚。李繼洋等[19]利用雷建峰已驗(yàn)證具有活性的其中2個(gè)啟動(dòng)子建立棉花的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系，在新海16胚性愈傷組織中成功實(shí)現(xiàn)基因的靶向編輯，編輯效率約為27%。

通常CRISPR/Cas9基因編輯體系一次只能編輯1個(gè)基因，而對(duì)于多基因控制的遺傳表型解析就顯得效率低下。為此Ma等[20]構(gòu)建了由多個(gè)U3和U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgDNA并串聯(lián)的CRISPR/Cas9基因編輯體系，能在擬南芥和水稻中同時(shí)編輯多個(gè)基因，大大提高了多基因編輯的效率，但該載體系統(tǒng)需要多個(gè)不同的U3和U6啟動(dòng)子。

基于以上的研究，為了驗(yàn)證其他具有轉(zhuǎn)錄活性的U3、U6啟動(dòng)子是否也能實(shí)現(xiàn)高效的編輯效率，為此本研究對(duì)克隆的GbU3-2P、GbU6-7P進(jìn)行功能鑒定，篩選出更多能用于棉花CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的U3和U6啟動(dòng)子，為構(gòu)建棉花CRISPR/Cas9基因多敲技術(shù)體系提供更多有效的U3和U6啟動(dòng)子。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原生質(zhì)體制備所用的供試材料為新海16，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶購(gòu)于Thermo公司；纖維素酶和離析酶由IUZMI株式會(huì)社代理提供，T4DNA連接酶、Blunt Zero平端載體、Trans5α感受態(tài)細(xì)胞、Taq DNA聚合酶、RNase A、1kb Plus DNA Ladder等均購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)公司；Phusion超保真DNA聚合酶購(gòu)于北京NEB公司。測(cè)序及引物合成均由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。T-GbU3-2P-5F-2::GUS-sgRNA，T-GbU6-7P-5F-6::GUS-sgRNA載體由本實(shí)驗(yàn)室保存[17-18]。35S-Cas9-ter-SK質(zhì)粒由中科院上海生理生態(tài)研究所提供[21]。

1.2 載體構(gòu)建

1.2.1棉花GGB基因編輯靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)選擇與靶向片段的制備。本研究選取的啟動(dòng)子為GbU3-2P、GbU6-7P。GGB靶基因序列（sgRNA）如表1。靶序列設(shè)計(jì)在PAM(5'-NGG-3')（the protospacer-adjacent motif）位點(diǎn)前，長(zhǎng)度為24個(gè)堿基（bp），并在PAM位點(diǎn)5'上游的切割位點(diǎn)處為限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。退火反應(yīng)體系為20μL，上下游靶序列各10μL（表1）；復(fù)性程序?yàn)椋浩鹗紲囟?5℃，每5 s降低0.5℃，直至20℃，形成雙鏈靶序列。

最后該靶序列經(jīng)退火復(fù)性插入到經(jīng)BbsⅠ酶切的T-GbU3-2P-5F-2::GUS-sgRNA，T-GbU6-7P-5F-6::GUS-sgRNA載體上（圖1）。

1.2.2基因編輯載體的構(gòu)建。將實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建好的T-GbU3-2P-5F-2，T-GbU6-7P-5F-6載體[17]保存菌液，搖菌（200 r·min－1，37℃，12～14 h）進(jìn)行提取質(zhì)粒。

對(duì)T-GbU3-2P-5F-2::GUS-sgRNA，T-GbU6-7P-5F-6::GUS-sgRNA載體進(jìn)行酶切（BbsⅠ），電泳檢測(cè)出現(xiàn)兩條帶（一條是GUS基因，條帶長(zhǎng)1 918 bp；一條是載體，條帶長(zhǎng)3 500 bp左右），回收目的片段。將靶序列與回收片段用T4連接酶連接過(guò)夜，使靶序列連接到經(jīng)BbsⅠ酶切的載體相應(yīng)位置上，使靶序列替換GUS片段，將U3/U6-靶序列-sgRNA載體，轉(zhuǎn)化Trans-5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切（KpnⅠ，HindⅢ）回收（GbU3-2P::靶序列-sgRNA、GbU6-7P::靶序列-sgRNA）。同時(shí)對(duì)35s-Cas9-ter-SK質(zhì)粒用KpnⅠ、HindⅢ酶切，并回收35s-Cas9-ter片段分別與目的片段用T4連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化后對(duì)重組質(zhì)粒用HindⅢ和KpnⅠ進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為GbU3-2P::GGB-sgRNA-Cas9、GbU6-7P::GGB-sgRNA-Cas9。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primers used in this study

圖1 靶序列插入位置示意圖Fig.1 Inserted position of target sequence

1.3 富集高濃度PCR片段

對(duì)帶有靶序列的載體進(jìn)行Polymerase chain reaction（PCR）擴(kuò)增，以富集到高濃度CRISPR/Cas9基因編輯的核心片段。具體方法參見(jiàn)李繼洋等文章[19]，采用超保真TransStart FastPfu Fly擴(kuò)增帶靶基因序列的編輯載體和空載體的核心系統(tǒng)區(qū)域，擴(kuò)增體系參照說(shuō)明書(shū)推薦體系，擴(kuò)增片段覆 蓋 有GGB靶 序 列 的GbU3-2P::sgRNA、GbU6-7P::sgRNA及35S-Cas9-ter兩個(gè)核心元件和沒(méi)有GGB靶序列的對(duì)照空載體核心元件，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后采用酚氯仿抽提和酒精沉淀法對(duì)其產(chǎn)物加以簡(jiǎn)單純化。

1.4 原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化

參考擬南芥已經(jīng)建立的原生質(zhì)體分離方法[22]，采用纖維素酶和離析酶雙酶體系制備棉花葉片的原生質(zhì)體，略有改動(dòng)。

首先配制含有1.5 %纖維素酶、0.4 %離析酶、0.5 mol·L－1甘 露 醇、20 mmol·L－1KCl、20 mmol·L－1MES、0.85 mL ddH2O，55℃水 浴10 min，充分溶解后，室溫放置冷卻后，再加入0.1 mol·L－1CaCl2、0.1% BSA的混合酶液5 mL，經(jīng)0.45μm纖維素微孔濾膜過(guò)濾待用。

其次取15 d左右幼苗（真葉剛展開(kāi)）的新鮮健壯的的子葉7～8片。用蒸餾水清洗表面，在吸水紙上晾干待用。準(zhǔn)備好刀片和鑷子，將下表皮撕去，之后葉肉細(xì)胞將裸露出來(lái)，平展于培養(yǎng)皿中，再用刀片將撕去表皮的部分切割成細(xì)長(zhǎng)條，用鑷子輕輕將去表皮的葉面置于酶解液中，使葉片完全浸泡在酶解液中。放置在回旋搖床上酶解（50 r·min－1）10～14 h，直至子葉葉肉完全酶解，酶解液成綠色為止。

待原生質(zhì)體酶解結(jié)束后，將酶解混合液慢慢混合均勻，取斜面槍頭蘸取含原生質(zhì)體酶解混合液滴在載玻片上，室溫下靜置3～5 min，放在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的形態(tài)，拍照并做記錄。若形態(tài)符合試驗(yàn)要求，就用少量的W5溶液重懸后，用槍頭輕輕吸取10μL原生質(zhì)體混合液，把蓋玻片（18 mm×18 mm）放置在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，將原生質(zhì)體懸浮液從側(cè)面緩緩打入到載玻片上，計(jì)算出原生質(zhì)體的個(gè)數(shù)，重復(fù)3次統(tǒng)計(jì)。

最后原生質(zhì)體制備好后，配制W5溶液（4 mmol·L－1MES、125 mmol·L－1CaCl2、154 mmol·L－1NaCl、5 mmol·L－1 KCl）、MMG溶液（0.4 mol·L－1甘露醇、15 mmol·L－1MgCl2、4 mmol·L－1MES）和WI溶液（0.5 mol·L－1甘露醇、20 mmol·L－1KCl、4 mmol·L－1 MES），取10～15μg富集的PCR產(chǎn)物，參照擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法[23-24]將富集產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至棉花原生質(zhì)體，于28℃，50 r·min－1避光過(guò)夜孵育轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體。

1.5 編輯效應(yīng)的檢測(cè)

過(guò)夜孵育轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體經(jīng)鏡檢拍照后，采用12 000 r·min－1離心1 min收集沉淀，棄去上清液后，將棉花原生質(zhì)體用植物基因組DNA提取試劑盒提取棉花原生質(zhì)體基因組DNA，方法參照Trans Easypure plant Genomic DNA Kit操作要求，將提取的DNA經(jīng)過(guò)濃度檢測(cè)后，取等質(zhì)量提取的DNA，在靶序列上找酶切位點(diǎn)（GbGGB采用ScaⅠ酶切）進(jìn)行過(guò)夜酶切和不酶切2種處理，分別以2種處理的原生質(zhì)體DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系參照NEB公司Phusion超保真DNA聚合酶推薦反應(yīng)體系，采用先酶切后PCR的方法對(duì)靶序列內(nèi)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)[19]，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)亮帶情況，進(jìn)行回收，初步檢測(cè)出突變的PCR產(chǎn)物，然后克隆、測(cè)序，采用DNAstar和DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，檢測(cè)棉花GGB靶序列內(nèi)是否有突變位點(diǎn)。根據(jù)GGB靶序列的測(cè)序結(jié)果，計(jì)算突變率。

1.6 靶基因內(nèi)不同區(qū)域突變頻率的計(jì)算

為了排除出現(xiàn)的堿基突變是PCR過(guò)程中引入隨機(jī)突變的可能性，為此對(duì)酶切前的棉花基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見(jiàn)表1（Test系列），對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆。隨機(jī)挑選100個(gè)長(zhǎng)勢(shì)均一的單菌落測(cè)序，通過(guò)DNAstar軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果，以40個(gè)堿基為一個(gè)計(jì)算單元，統(tǒng)計(jì)包括靶序列區(qū)及其前后各2個(gè)40 bp區(qū)域突變堿基數(shù)，并計(jì)算相應(yīng)區(qū)域堿基突變的頻率，利用制圖軟件繪制Test區(qū)域堿基突變頻率折線圖。

2 結(jié)果

2.1 編輯載體構(gòu)建

采用酶切方式檢測(cè)上述構(gòu)建的載體，結(jié)果表明構(gòu)建載體大小符合預(yù)期設(shè)計(jì)，構(gòu)建帶有靶序列的U3:sgDNA、U6:sgDNA（圖2），連接的GbGGB靶序列的GbU3-2P、GbU6-7P不同啟動(dòng)子的Cas9的編輯載體均于構(gòu)建成功（圖3）。

圖2 構(gòu)建帶有靶序列的U3:sgDNA、U6:sgDNAFig.2 Construction of U3:sgDNA and U6:sgDNA with target sequence

圖3 GbU3-2P::GGB-sgRNA-Cas9、GbU6-7P::GGB-sgRNA-Cas9基因編輯載體的酶切鑒定Fig.3 Identification of GbU3-2P::GGB-sgRNACas9、GbU6-7P::GGB-sgRNA-Cas9 gene editing vectors using restriction enzyme digestion

2.2 原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化

體系優(yōu)化獲得的原生質(zhì)體在顯微鏡下呈圓球狀，形態(tài)飽滿，符合去壁細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)計(jì)算其數(shù)量可達(dá)106mL－1以上，通過(guò)顯微鏡檢測(cè)觀察顯示，僅極少原生質(zhì)體呈破碎狀態(tài)，證明使用該體系制備的原生質(zhì)體可以滿足本研究的后續(xù)試驗(yàn)要求。經(jīng)轉(zhuǎn)化并過(guò)夜孵育后的原生質(zhì)體，有少量細(xì)胞成簇聚集現(xiàn)象，再次在顯微鏡下觀察細(xì)胞活性狀態(tài)，說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的棉花原生質(zhì)體狀態(tài)良好（圖4）。

圖4 棉花原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化前后形態(tài)圖Fig.4 Morphological change of cotton protoplasts before and after transformation

2.3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的棉花GGB基因靶位點(diǎn)的編輯和突變檢測(cè)

將構(gòu)建好的基因編輯載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，對(duì)獲得的原生質(zhì)體基因組DNA進(jìn)行不酶切和酶切兩種處理，然后以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5（1）（2）所示，酶切前攜帶靶基因序列的載體轉(zhuǎn)化樣品和空白對(duì)照載體轉(zhuǎn)化樣品都能擴(kuò)增出預(yù)期500 bp左右的條帶，并且亮度相近。而經(jīng)ScaⅠ酶切后攜帶靶基因序列的載體轉(zhuǎn)化樣品，由于靶區(qū)域限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)被編輯突變，限制性內(nèi)切酶不能進(jìn)行切割，維持了模板DNA的完整性，則PCR擴(kuò)增出預(yù)期條帶的亮度比用ScaⅠ酶切后的空白對(duì)照載體的亮。

本試驗(yàn)對(duì)酶切后PCR片段進(jìn)行回收連接、克隆并送測(cè)序，通過(guò)測(cè)序結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在棉花新海16 GGB內(nèi)靶位點(diǎn)有個(gè)別堿基發(fā)生突變的現(xiàn)象。發(fā)生突變的位置位于PAM位點(diǎn)上游限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)區(qū)域的基因靶位點(diǎn)上，GbU3-2P、GbU6-7P啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9基因編輯載體均出現(xiàn)不同類(lèi)型的突變（圖6），全部為堿基置換（包括轉(zhuǎn)換和顛換兩種類(lèi)型）。

為了排除堿基突變是由于PCR過(guò)程中引入隨機(jī)突變的可能性，為此對(duì)酶切前的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆，隨機(jī)挑選100個(gè)陽(yáng)性候選單克隆菌落測(cè)序，通過(guò)DNAstar軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果，以40個(gè)堿基為一個(gè)計(jì)算單元，對(duì)包括靶序列區(qū)及其前后各2個(gè)40 bp區(qū)域堿基突變個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算相應(yīng)區(qū)域堿基突變頻率，利用制圖軟件繪制Test區(qū)域堿基突變頻率折線圖。結(jié)果顯示靶序列20個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)的堿基突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兩側(cè)相鄰各2個(gè)40 bp區(qū)域內(nèi)堿基的突變頻率（圖7）。

上述結(jié)果證明基于海島棉GbU3-2P、GbU6-7P啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9基因編輯載體系統(tǒng)均能棉花中實(shí)現(xiàn)靶向基因編輯的功能。

圖5 酶切/PCR檢測(cè)CRISPR/Cas9基因組編輯效應(yīng)Fig.5 Digestion/PCR for editing effect of CRISPR/Cas9

圖6 GbGGB-sg RNA靶位點(diǎn)編輯效應(yīng)(堿基置換型)測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Sequencing of GbGGB-sgRNA target site that were edited(type of base substitution)

圖7 Gb GGB-sg RNA2靶位點(diǎn)區(qū)域(guide RNA)及其兩側(cè)位點(diǎn)的突變效率分析Fig.7 Mutation efficiency of GbGGB-sg RNA2 target site(guide RNA)and its two flanking region

3 討論

由RNA介導(dǎo)的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，作為一項(xiàng)全新的第三代人工核酸酶技術(shù)，其載體構(gòu)建簡(jiǎn)單、成本消耗低，是作物功能基因組學(xué)和分子育種研究的強(qiáng)有力的工具，目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于多種植物的基因組編輯研究[25]，該技術(shù)在植物中的研究已逐漸趨于成熟，而CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)剛剛在陸地棉中成功建立[26]。但利用棉花內(nèi)源U6或U3啟動(dòng)子在棉花中建立CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用報(bào)道卻很少。雷建峰已經(jīng)從棉花中克隆了2個(gè)U3啟動(dòng)子、5個(gè)U6啟動(dòng)子，并驗(yàn)證它們?cè)诿藁ㄖ芯哂修D(zhuǎn)錄活性[18]，但是基于這些啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能否在棉花中實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源基因的編輯，目前還不清楚。本研究利用已克隆的1個(gè)棉花內(nèi)源的U3啟動(dòng)子和1個(gè)U6啟動(dòng)子構(gòu)建了棉花的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系并成功地實(shí)現(xiàn)了基因編輯效應(yīng)，為建立多敲CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系提供了更多的啟動(dòng)子。

3.1 CRISPR/Cas9基因組編輯效應(yīng)檢測(cè)

采用先酶切后PCR的方式是一種簡(jiǎn)單、快速、有效的檢測(cè)基因編輯效應(yīng)的方法。Chen等[11]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)陸地棉的兩個(gè)基因（GhCLA1和GhVP）在棉花子葉原生質(zhì)體中進(jìn)行了定點(diǎn)突變研究，試驗(yàn)結(jié)果表明靶標(biāo)位點(diǎn)大多數(shù)情況是單個(gè)堿基的替換，少數(shù)是單個(gè)堿基的刪除或插入。本研究利用已克隆的GbU3-2P、GbU6-1P、GbU6-7P啟動(dòng)子構(gòu)建了棉花的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系并在新海16葉片原生質(zhì)體中進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果顯示靶位點(diǎn)的突變類(lèi)型全部為堿基替換，未檢測(cè)到堿基缺失和堿基插入，這與Chen等[11]的研究結(jié)果類(lèi)似，但穩(wěn)定轉(zhuǎn)化能檢測(cè)到較高頻率的堿基缺失和堿基插入?？赡艿脑蛞皇桥c穩(wěn)定轉(zhuǎn)化相比，原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的基因編輯系統(tǒng)的相關(guān)成分在原生質(zhì)體中表達(dá)水平較低，且不能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，也就不能高效持續(xù)切割靶序列，而獲得靶序列破壞嚴(yán)重的結(jié)果。第二方面的原因可能是選用的U3和U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性不高，不能高效產(chǎn)生SgRNA去引導(dǎo)Cas9高效持續(xù)切割靶序列。原因3可能是我們測(cè)序的克隆數(shù)依然偏少，沒(méi)能檢測(cè)到本來(lái)就比例偏少的插入和缺失克隆，進(jìn)一步擴(kuò)大測(cè)序的克隆數(shù)，可能就能檢測(cè)到插入和缺失的突變類(lèi)型。

空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化樣品的模板DNA不會(huì)被編輯突變，限制性內(nèi)切酶可以進(jìn)行切割，理論上應(yīng)該不會(huì)出現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。然而我們空載體轉(zhuǎn)化樣品卻出現(xiàn)了較弱的PCR條帶，盡管我們?cè)黾恿讼拗菩詢?nèi)切酶量，也延長(zhǎng)了酶切的時(shí)間，但對(duì)照依然有PCR產(chǎn)物。原因可能是棉花屬多糖多酚植物，基因組在提取過(guò)程中殘留的多糖和酚類(lèi)物質(zhì)在酶切反應(yīng)時(shí)都可能抑制限制性內(nèi)切酶活性，導(dǎo)致靶序列模板酶切不徹底，再經(jīng)PCR擴(kuò)增時(shí)，對(duì)照樣品基因組DNA酶切后PCR產(chǎn)物依然還有微量的條帶[27-28]。

PCR擴(kuò)增常常會(huì)引入隨機(jī)的堿基錯(cuò)配，即使使用高保真的DNA聚合酶，也會(huì)如此。本實(shí)驗(yàn)中靶序列單堿基的改變是否是因?yàn)镻CR擴(kuò)增過(guò)程中堿基隨機(jī)配對(duì)錯(cuò)誤產(chǎn)生的突變？為排除這個(gè)可能性，對(duì)靶位點(diǎn)及靶位點(diǎn)兩側(cè)的DNA序列突變的頻率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示非靶序列位點(diǎn)處確實(shí)也可以檢測(cè)到單堿基替換，但其突變的頻率遠(yuǎn)低于靶位點(diǎn)堿基的突變頻率，表明靶序列區(qū)堿基的突變確實(shí)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向編輯的結(jié)果。本研究結(jié)果表明棉花內(nèi)源U3-2P、U6-7P啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的棉花基因組靶向編輯，克隆測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)的突變多為堿基的替換，這與海島棉、陸地棉原生質(zhì)體中的基因編輯結(jié)果類(lèi)似。

4 結(jié)論

本研究證明了棉花內(nèi)源U3-2P、U6-7P啟動(dòng)子均能有效地驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的棉花基因組靶向編輯。該體系可以用于定向創(chuàng)制棉花的突變體，為棉花功能基因組學(xué)研究提供重要的技術(shù)工具。