王曉婧，李思嘉，劉瑞顯,2*，張國偉，楊長琴,2，倪萬潮,2

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014；2.江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210014）

棉花是我國最重要的經(jīng)濟(jì)作物。近年來隨著各大棉區(qū)植棉勞動(dòng)力結(jié)構(gòu)的改變和勞動(dòng)力成本的大幅上升，傳統(tǒng)植棉的比較效益持續(xù)降低，植棉面積大幅減少[1]。因此，急需大力發(fā)展棉花生產(chǎn)機(jī)械化，解決生產(chǎn)過程中勞動(dòng)力短缺的問題[2]。推廣機(jī)采棉已經(jīng)成為我國棉花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必然選擇[1]。

化學(xué)脫葉是棉花實(shí)現(xiàn)機(jī)械采收的核心技術(shù)，主要運(yùn)用植物生長調(diào)節(jié)劑（主要是噻苯隆Thidiazuron,TDZ），干預(yù)棉花生理生化過程，加速植株衰老，實(shí)現(xiàn)脫葉[3]?；瘜W(xué)脫葉效果好壞成為棉花機(jī)采能否順利實(shí)施的關(guān)鍵。脫葉效果不理想、含雜率高往往造成棉花采收效率降低、清花成本增加和纖維品質(zhì)下降[4]。因此，近年來眾多研究者在棉花脫葉劑的劑型選擇、劑量配方以及噴施時(shí)期、噴施方法方面進(jìn)行了深入的研究[5-7]，篩選出了適應(yīng)不同棉區(qū)的脫葉劑及其使用方法。但是目前我國棉花脫葉催熟技術(shù)并不完善，突出問題之一是棉花脫葉不徹底導(dǎo)致機(jī)采棉含雜率較高。這主要是由于新疆棉花采用“矮、密、早”的栽培模式，在黃河與長江流域棉區(qū)為實(shí)現(xiàn)機(jī)采棉的集中成鈴?fù)滦酰啻蠓岣叻N植密度[8]，棉田密度的提高常常導(dǎo)致噴霧機(jī)只能將脫葉劑噴施在中上部葉片上，而下部葉片因不能有效著藥而不脫落，導(dǎo)致整體脫葉效果差[9]。

因此，隨著我國棉花收獲機(jī)械化進(jìn)程的推進(jìn)，迫切需要明確脫葉劑影響棉花葉片脫落發(fā)生的規(guī)律及生理機(jī)制[10]。前人認(rèn)為對棉花進(jìn)行化學(xué)脫葉，也是對其生長的脅迫[11]。高麗麗等[12]研究表明，噴施脫葉劑后棉花葉片發(fā)生光抑制，光系統(tǒng)II（Photosystem II,PSII）復(fù)合體受到損傷并伴隨光合電子傳遞受阻，光合功能受損，而丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量升高、內(nèi)源生長素（Auxin,IAA）含量下降，葉片膜系統(tǒng)受破壞嚴(yán)重[11]。但是，有關(guān)棉花噴施脫葉劑后，未著藥葉片的生理功能如何變化，目前未見報(bào)道。而明確棉花噴施脫葉劑后未著藥葉片的生理變化，將對完善機(jī)采棉脫葉催熟技術(shù)有重要的指導(dǎo)意義。

本文深入研究棉花噴施脫葉劑噻苯隆后，其相鄰未著藥葉片的光能吸收、傳遞、轉(zhuǎn)換特性、內(nèi)源保護(hù)酶活性及內(nèi)源激素含量等生理指標(biāo)的變化，旨在為提高脫葉效果，完善脫葉催熟技術(shù)，促進(jìn)機(jī)采棉的迅速推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

于2017年3－8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人工氣候室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。以中棉所50（CCRI 50）為材料，挑選飽滿均勻的種子，經(jīng)3.0%（體積分?jǐn)?shù)）的雙氧水消毒10 min后用去離子水沖洗5次；之后放置于25℃的恒溫箱中催芽24 h，再播種于裝有基質(zhì)的盆缽（直徑10 cm，高15 cm）中，每盆播種2粒，于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。待棉花子葉平展后，每盆留生長一致的壯苗1株，待棉苗長至7片真葉時(shí)進(jìn)行以下2種處理：一是噴清水（對照，CK）；二是噴脫葉劑，將第4、5主莖葉表面用毛筆均勻涂抹0.1%的TDZ，使整張葉片正面均勻著藥但無藥滴滴下。每個(gè)處理種植50盆，共計(jì)100盆。人工氣候室光源為生物鈉燈，光照度（450±30）μmol·m－2·s－1，光照時(shí)間12 h，晝/夜溫度（30±2）℃/（25±2）℃。分別在處理當(dāng)天及處理后1 d、3 d、6 d、10 d測定第3主莖葉（未涂抹TDZ）的光合特性與葉綠素?zé)晒鈪?shù)，之后將葉片用液氮速凍后取回進(jìn)行內(nèi)源保護(hù)酶活性與內(nèi)源激素含量的測定。

1.2 測定內(nèi)容與方法

1.2.1脫葉率調(diào)查方法。分別在TDZ施用后1 d、3 d、6 d、10 d調(diào)查著藥葉片（第4、5主莖葉）與未著藥葉片（第3主莖葉）的脫葉率。

脫葉率=（施藥前葉片數(shù)－施藥后葉片數(shù)）/施藥前葉片數(shù)。

1.2.2凈光合速率。分別在TDZ施用當(dāng)天及施用后1 d、3 d、6 d、10 d采用LI-6800便攜式光合熒光儀（美國LI-COR公司）測定第3主莖葉的凈光合速率（Pn）。儀器使用開放式氣路，內(nèi)置光源，光照度為1 300μmol·m－2·s－1。測定時(shí)每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)。與光合速率測定同步，用LI-6800（美國LI-COR公司）便攜式光合熒光儀測定第3主莖葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測定時(shí)每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.4內(nèi)源保護(hù)酶活性與丙二醛含量。待1.2.2與1.2.3項(xiàng)目測定完后，立即將葉片取回，用液氮速凍后存于－40℃冰箱中用于內(nèi)源保護(hù)酶活性與內(nèi)源激素含量的分析。用氮藍(lán)四唑（Nitro-blue tetrazolium,NBT）法測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性[13]，用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（Peroxidase,POD）活性[13]，用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量[13]。

1.2.5內(nèi)源激素含量。按照Pan等[14]的方法進(jìn)行樣品內(nèi)源激素的提取，之后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]測定脫落酸（Abscisic acid,ABA）、生長素（Auxin,IAA）的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel數(shù)據(jù)處理軟件分析數(shù)據(jù)和制作圖表，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，用最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)處理間平均值差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用TDZ對不同部位葉片脫落率的影響

由表1可見，棉花葉片涂抹TDZ后，其脫落率迅速上升，3 d后脫葉率為80%，6 d后TDZ涂抹的葉片全部脫落。而其相鄰未著藥葉片，在試驗(yàn)期間無任何脫落。

表1 施用脫葉劑（TDZ）對不同部位葉片脫落率的影響Table 1 Effect of defoliants application on the cotton leaf abscission

2.2 施用TDZ對未著藥葉片凈光合速率的影響

由圖1可見，TDZ處理的未著藥棉花葉片Pn迅速降低，處理后3 d時(shí)最低，6 d、10 d時(shí)逐漸回升。TDZ處理后1 d、3 d、6 d，未著藥棉花葉片Pn較CK分別降低了39.6%、63.1%、39.4%，而在處理后10 d，與CK已無差異。

2.3 施用TDZ對未著藥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3.1最大光化學(xué)效率。最大光化學(xué)效率（Maximum quantum yield of PSII,Fv/Fm）是暗適應(yīng)下PSII的最大光化學(xué)效率或PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率[16]，可以作為衡量PSII光抑制程度的指標(biāo)。由圖2-A可見，TDZ處理后未著藥棉花葉片F(xiàn)v/Fm迅速降低，處理后1 d、3 d分別較CK降低了7.9%、7.8%，而在處理后6 d、10 d，未著藥葉片與CK已無明顯差異。

圖1 施用脫葉劑（TDZ）對未著藥葉片凈光合速率的影響Fig.1 Effect of defoliants application on the net photosynthetic rate of cotton leaf without defoliants

圖2 施用脫葉劑（TDZ）對未著藥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.2 Effect of defoliants application on chlorophyll fluorescence of cotton leaf without defoliants

2.3.2量子產(chǎn)量與電子傳遞速率。PSII量子產(chǎn)量（Actual photochemical efficiency,ΦPSII）代表PSII非環(huán)式電子傳遞效率或光能捕獲的效率，電子傳遞速率（Electron transport rate,Ret）代表的是表觀光合量子傳遞速率[17]。由圖2-B可見，TDZ處理后，未著藥棉花葉片ΦPSII顯著低于CK，處理后1 d、3 d、6 d分 別 較CK降 低 了29.5%、39.3%、27.7%，但10 d后，處理間已無明顯差異。不同處理的Ret亦表現(xiàn)出相同的變化趨勢，TDZ處理后的1 d、3 d、6 d，未著藥棉花葉片較CK降低了25.7%、49.2%、42.3%（圖2-C）。

2.3.3光化學(xué)猝滅系數(shù)與非光化學(xué)猝滅系數(shù)。光化學(xué)猝滅系數(shù)（Photochemical quenching,qP）反映PSII天線色素捕獲的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額，非光化學(xué)猝滅系數(shù)（Nonphotochemical quenching,qNP）則反映PSII天線色素吸收的光能不用于光化學(xué)電子傳遞而以熱的形式耗散掉的部分[17]。由圖2-D，E可見，TDZ處理顯著降低了未著藥棉花葉片的qP，而增大了NPQ。TDZ處理后1 d、3 d、6 d未著藥葉片qP分別較CK降低了22.1%、21.2%、18.7%，而其qNP較CK增大了42.4%、34.6%、32.8%。在處理后10 d，qP和qNP不同處理間差異較小。

2.4 施用TDZ對未著藥葉片內(nèi)源保護(hù)酶活性的影響

從圖3看出，TDZ處理后1 d，未著藥葉片的SOD活性與CK差異較??；處理后3 d、6 d、10 d，未著藥葉片SOD活性顯著高于CK。而POD活性變化較小，TDZ處理后1 d、3 d、6 d，未著藥葉片的POD活性與CK差異較??；處理后10 d，未著藥葉片的POD活性明顯高于CK。

圖3 施用脫葉劑（TDZ）對未著藥葉片內(nèi)源保護(hù)酶活性的影響Fig.3 Effect of defoliants application on endogenous enzyme activity of cotton leaf without defoliants

2.5 施用TDZ對未著藥葉片丙二醛含量的影響

MDA作為活性氧毒害引發(fā)的細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量的變化可以表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對逆境脅迫反應(yīng)的強(qiáng)弱。由圖4看出，TDZ處理后1 d，未著藥葉片MDA含量與CK無差異；而隨處理時(shí)間（3 d、6 d、10 d）的延長，未著藥葉片MDA含量明顯低于CK。

圖4 施用脫葉劑（TDZ）對未著藥葉片MDA含量的影響Fig.4 Effect of defoliants application on MDA contents of cotton leaf without defoliants

2.6 施用TDZ對未著藥葉片內(nèi)源激素含量的影響

由圖5可見，TDZ處理后1 d，未著藥葉片ABA含量與CK無差異；而在處理后的3 d、6 d，未著藥葉片ABA含量明顯低于CK；處理后10 d，2個(gè)處理間又無明顯差異。IAA含量變化與ABA不同，TDZ處理后1 d、3 d、6 d、10 d，2個(gè)處理之間并無明顯差異。

3 討論

自1976年德國Cshering公司成功合成出TDZ以來，TDZ一直作為棉花大田的主要脫葉劑。但是，目前TDZ在葉片脫落過程中的生理、分子生物學(xué)機(jī)制仍不完全清楚[10-12]；而對有關(guān)棉花噴施脫葉劑后未著藥葉片的生理功能如何變化，更未見研究。

3.1 施用TDZ對葉片光合特性的影響

圖5 施用脫葉劑（TDZ）對未著藥葉片內(nèi)源激素含量的影響Fig.5 Effect of defoliants application on endogenous hormone contents of cotton leaf without defoliants

本研究發(fā)現(xiàn)，涂抹TDZ的棉花葉片脫落率在3 d后即超過了80%，而其相鄰未著藥葉片在整個(gè)試驗(yàn)過程中未見脫落。前人[12]研究表明，噴施脫葉劑后棉花葉片發(fā)生光抑制，PSII復(fù)合體受到損傷并伴隨光合電子傳遞受阻，光合功能受損。本研究表明，施用TDZ后，相鄰未著藥棉花葉片凈光合速率（Pn）迅速降低，但是Pn的降低并無持續(xù)性，在施藥后10 d恢復(fù)到對照水平。進(jìn)一步分析葉綠素?zé)晒馓匦园l(fā)現(xiàn)，與Pn表現(xiàn)趨勢一致：施用TDZ后，相鄰未著藥棉花葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSII、Ret以及qP迅速降低，而qNP迅速升高；但隨后各葉綠素?zé)晒鈪?shù)恢復(fù)到對照水平。這說明在涂抹TDZ后，相鄰未著藥棉花葉片的光合性能與光反應(yīng)中心部分失活，電子傳遞過程受阻，抑制光合色素將捕獲的光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能；但是，隨著施藥葉片的脫落，未著藥葉片光合功能可以迅速恢復(fù)。

3.2 施用TDZ對葉片內(nèi)源保護(hù)酶活性的影響

在外界脅迫下，作物體內(nèi)SOD、過氧化氫酶（Catalase,CAT）、POD等內(nèi)源保護(hù)酶協(xié)調(diào)作用可以有效地清除活性氧自由基，改善其抗逆性[18]。前人研究表明，棉花脫葉劑處理后初期葉片的SOD、POD和CAT活性上升較快，清除活性氧和保護(hù)細(xì)胞膜的能力有所增強(qiáng)，但在處理后期，SOD、POD和CAT活性下降，MDA含量上升，棉花葉片衰老加快[11]。而本研究表明，施用TDZ后，未著藥棉花葉片的SOD活性顯著升高，POD活性變化較小，MDA含量卻顯著低于CK。這可能是由于在TDZ處理初期（3 d內(nèi)），施藥葉片受脅迫較重，未著藥葉片亦發(fā)生了脅迫反應(yīng)，啟動(dòng)了抗氧化脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，SOD活性升高；在而在處理后期施藥葉片脫落，由于TDZ在棉株體內(nèi)的傳導(dǎo)性較差[21]，未著藥葉片脅迫反應(yīng)解除，但SOD活性仍較高，因此MDA含量低于CK。

3.3 施用TDZ對葉片內(nèi)源激素含量的影響

化學(xué)脫葉主要是通過對植物體內(nèi)內(nèi)源激素的合成、運(yùn)輸、代謝、與受體的結(jié)合以及此后的信號傳導(dǎo)過程進(jìn)行干預(yù)，使原有的生長激素平衡遭到破壞，從而達(dá)到預(yù)定的脫葉催熟目的[3]。已有的研究表明，棉花噴施TDZ可顯著促進(jìn)葉片ABA的生成[19]。高麗麗等[11]研究亦發(fā)現(xiàn)，棉花噴施TDZ后葉片中ABA含量顯著升高，而IAA含量逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)，TDZ處理后，未著藥葉片ABA含量并沒有顯著升高，IAA含量與對照相比亦無明顯差異。這表明，未著藥葉片的內(nèi)源激素平衡受TDZ的影響較小，這可能也是未著藥葉片并未脫落的主要原因之一。

進(jìn)行化學(xué)脫葉是棉花機(jī)械化采收必不可少的重要技術(shù)措施。棉花脫葉效果的好壞直接影響最終機(jī)采效果，而目前生產(chǎn)中普遍存在棉花脫葉劑施藥不均勻等問題[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，棉花施用TDZ后著藥葉片可以快速脫落，但是未著藥葉片卻不脫落。已有研究認(rèn)為，脫葉催熟劑有很好的滲透作用，但大多沒有傳導(dǎo)作用[3]。因此，在生產(chǎn)中，必須從配方優(yōu)化、噴施方法、器具選擇等方面進(jìn)行創(chuàng)新研究，保證脫葉劑藥液與葉片充分接觸，以提高脫葉效率。

另外，有關(guān)脫葉劑調(diào)節(jié)棉花葉片的生理與分子基礎(chǔ)研究目前仍很薄弱，棉花葉片中TDZ的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理仍不清楚，棉鈴不同發(fā)育階段纖維品質(zhì)形成對TDZ的反應(yīng)機(jī)制也未見報(bào)道。因此，應(yīng)進(jìn)一步深入研究棉花脫落以及纖維發(fā)育等生理過程對化學(xué)脫葉劑的響應(yīng)機(jī)理，并不斷完善棉花脫葉催熟技術(shù)。