郝 杰，邵瑞婷，姜 潔,，賀小蔚

（1.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心，北京 100041；2.沃特世科技有限公司，北京 100026）

氟蟲腈商品名為銳勁特，是法國Rhone-Poulenc公司開發(fā)的世界上首個苯基吡唑類殺蟲劑[1]，主要作用是通過與α-氨基丁酸受體結(jié)合，抑制氯離子通道，破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而殺滅昆蟲[2]。氟蟲腈殺蟲譜廣，具有觸殺、胃毒和中毒內(nèi)吸作用，與現(xiàn)有的殺蟲劑無交互抗性，對已產(chǎn)生常規(guī)殺蟲劑抗性的害蟲有較好的防治效果，可適用于水稻、玉米、棉花及其他廣泛經(jīng)濟作物的蟲害防治中[3-4]。氟蟲腈自推出伊始，就被眾多農(nóng)藥專家推薦為代替高毒有機磷農(nóng)藥的選擇之一，成為農(nóng)藥界追捧的熱點[5]。但隨著使用的推廣，關(guān)于氟蟲腈及其在農(nóng)產(chǎn)品中代謝產(chǎn)物的研究也越發(fā)深入，涉及到了劑量評估、毒性監(jiān)測及環(huán)境友好度評價等多方面[6-8]。氟蟲腈是一種化學(xué)性質(zhì)活潑的化合物，在施用后，經(jīng)過水解、光解等作用，會生成3 種代謝產(chǎn)物氟蟲腈砜（MB46136）、氟蟲腈硫醚（MB45950）和氟甲腈（MB46513）[9]。而經(jīng)過對代謝物毒性的研究，這三者的毒性要高于氟蟲腈原藥[10]，氟蟲腈被世界衛(wèi)生組織列為“對人類有中等毒性”的化學(xué)品。

鑒于氟蟲腈對甲殼類水生生物和蜜蜂具有高風(fēng)險，在環(huán)境中降解慢，在保護環(huán)境的大背景下，我國農(nóng)業(yè)部于2009年發(fā)布公告停止生產(chǎn)銷售氟蟲腈農(nóng)藥[11]。同時在GB 2763—2016 《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，對植物源性食品中氟蟲腈殘留量進行了嚴格的限定[12]。國外方面，歐盟做出規(guī)定氟蟲腈不得用于人類食品產(chǎn)業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過程，也做出了食品中氟蟲腈限量的詳細規(guī)定，包括動物源性食品雞蛋和雞肉中0.005 mg/kg的最大允許殘留量[13]。但是近年來發(fā)現(xiàn)偶有因農(nóng)藥隱性添加而導(dǎo)致氟蟲腈陽性檢出的情況，而荷蘭、德國等歐洲16 國及韓國等地更是爆出了大規(guī)模的氟蟲腈污染雞蛋的食品安全事件，并造成了廣泛的惡劣影響[14]。

目前，測定食品中氟蟲腈的測定方法主要有氣相色譜法[15-16]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17-19]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-23]等。GB 2763—2016中規(guī)定，氟蟲腈的殘留標志物為氟蟲腈、MB46513、MB46136、MB45950之和；歐盟規(guī)定殘留標志物為氟蟲腈和MB46136之和，均涉及到氟蟲腈代謝物的含量測定。而目前的標準方法和報道文獻方法中大多集中在原藥的測定上，僅有極少部分對氟蟲腈代謝物的測定進行方法研究。Cheng Youpu等[24]使用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法對氟蟲腈原藥及3 種代謝物進行測定，周昱等[25]使用固相微萃取-氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對原藥和4 種代謝物進行測定，但以上這些研究均應(yīng)用于蔬果茶葉中，目前鮮見動物源性食品中氟蟲腈及其代謝物的測定方法有報道。

圖1 氟蟲腈及3 種代謝物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of fipronil and its three metabolites

本實驗運用QuEChERS法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對雞蛋、雞肉等動物源性食品基質(zhì)中氟蟲腈以及MB46513、MB46136、MB45950等代謝物的測定進行研究。與常規(guī)方法相比，本方法提高了檢測效率，擴大了適用范圍，并能夠監(jiān)測法規(guī)所要求的全部殘留標志物的含量。經(jīng)方法驗證，方法靈敏度、精密度和檢出限均符合殘留分析的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、雞肉 市購。

氟蟲腈、氟蟲腈砜（MB46136）、氟蟲腈硫醚（MB45950）、氟甲腈（MB46513） 德國Dr. E公司；甲醇、甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國Fisher公司；乙腈、無水硫酸鎂、氯化鈉、二水合檸檬酸鈉、三水合二檸檬酸氫二鈉（均為分析純） 北京化學(xué)試劑廠；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（6 mL/200 mg）美國Waters公司；實驗用水為Milli-Q制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源及Masslynx 4.1 SCN 803軟件） 美國Waters公司；X1R高速冷凍離心機 美國Thermo公司；Milli-Q純水儀 美國Merck-Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取各標準品于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解，定容至刻度，配制成1 000 μg/mL的標準儲備液，轉(zhuǎn)入棕色瓶中置于－20 ℃環(huán)境中保存。根據(jù)實驗需要用乙腈稀釋成混合標準工作液。

1.3.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速 0.4 mL/min；柱溫 35 ℃；流動相：A為甲醇，B為5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）； 梯度洗脫條件：0～0.5 min 50%～70% A，0.5～3.0 min 70% A，3.0～3.5 min 70%～99% A，3.5～4.5 min 99% A，4.5～5.0 min 99%～50% A，5.0～6.0 min 50% A；進樣量2 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源；負離子模式電離；多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測；毛細管電壓1.00 kV；離子源溫度150 ℃；錐孔氣流量150 L/h；脫溶劑氣溫度450 ℃；脫溶劑氣流量900 L/h。氟蟲腈及其代謝物的色譜-質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物色譜-質(zhì)譜參數(shù)Table1 Chromatographic and MS parameters for fipronil and its metabolites

1.3.4 樣品預(yù)處理

雞蛋取內(nèi)容物，充分打散后，10 000 r/min均質(zhì)1 min。雞肉樣品攪碎后，10 000 r/min均質(zhì)1 min。取2 g經(jīng)充分均質(zhì)的樣品于50 mL旋蓋離心管中，加入10 mL水充分渦旋進行分散后，加入10 mL乙腈，混勻后超聲提取30 min，隨后加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g三水合二檸檬酸氫二鈉，劇烈振搖1 min，于4 ℃、10 000 r/min離心4 min。取0.5 mL乙腈層和0.5 mL水充分混勻后過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.4 定性、定量方法

定性方法：按照超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定試樣和標準工作溶液，記錄試樣和標準溶液中氟蟲腈及代謝物的色譜保留時間，以相對于最強離子豐度的百分比作為定性離子對的相對豐度，記錄濃度相當?shù)脑嚇优c標準工作溶液中相應(yīng)成分的相對豐度。當實驗中檢出與標準品的色譜保留時間一致的色譜峰，并且相對離子豐度允許偏差不超過GB/T 27404—2008中的規(guī)定范圍，可以確定試樣中檢出相應(yīng)氟蟲腈或其代謝物。

定量方法：以基質(zhì)加標標準曲線的系列質(zhì)量濃度為橫坐標，相應(yīng)樣品在儀器中各化合物色譜峰響應(yīng)峰面積為縱坐標，做回歸曲線。試樣中定性檢出目標化合物時，將對應(yīng)色譜峰的響應(yīng)峰面積代入回歸曲線方程中，計算得到試樣中該化合物的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

分別配制30 ng/mL的各化合物標準品，使用電噴霧質(zhì)譜用蠕動泵持續(xù)進樣，與適當流速的流動相混合后注入質(zhì)譜，對氟蟲腈及代謝物分別進行質(zhì)譜參數(shù)的確定。由于氟蟲腈及代謝物結(jié)構(gòu)中含有較多鹵代基，在離子源內(nèi)易形成負離子，且響應(yīng)強度較好。因此選擇較低的毛細管電壓，以降低基質(zhì)雜質(zhì)可能帶來的干擾。優(yōu)化錐孔電壓使得母離子豐度最大且穩(wěn)定，開啟碰撞氣后，優(yōu)化碰撞能量，選取響應(yīng)豐度較高、易得到、出峰穩(wěn)定的幾個碎片離子作為子離子。再通過配制空白雞蛋基質(zhì)標準溶液，排除易受基質(zhì)干擾的碎片，得到2 對監(jiān)測離子對，選擇響應(yīng)豐度較高、干擾較少的作為定量離子對。

2.1.2 分離條件的選擇

氟蟲腈與其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為接近，且極性均偏弱，在參考已報道的文獻資料[26-29]的基礎(chǔ)上，因此選擇BEH C18色譜柱作為分離介質(zhì)。對比使用不同流動相配比及梯度設(shè)置時，4 個化合物的保留時間和分離度參數(shù)。分別對比使用乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-水、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）等流動相體系。保留時間結(jié)果如表2所示?？梢钥吹绞褂眉状?酸化緩沖液的體系時，4 個化合物的色譜行為有分離的趨勢。調(diào)整洗脫梯度條件，使4個化合物能夠達到基線分離，獲得合適的色譜分離條件。圖1為空白雞蛋基質(zhì)提取液添加1 ng/mL標準品所得的總離子流圖。

表2 不同流動相組成下各化合物保留時間Table2 Retention times for the analytes under different mobile phase compositions

圖1 優(yōu)化條件下的色譜分離圖Fig.1 Chromatographic separation under optimized conditions

2.2 前處理技術(shù)的優(yōu)化

2.2.1 提取條件的選擇

氟蟲腈屬于中等偏弱極性化合物，在提取過程中易溶解于有機試劑中。QuEChERS法[30]自發(fā)明以來，經(jīng)不斷發(fā)展，已成為農(nóng)藥殘留分析的首選方法，但QuEChERS推薦方法均主要用于分析植物源性食品，因此，本實驗對用QuEChERS法提取雞蛋等動物源性食品中氟蟲腈農(nóng)藥的條件進行比較優(yōu)化。

實驗對比使用乙腈或甲醇直接提取，以及使用QuEChERS法結(jié)合不同除水分散劑進行萃取的提取效率。制作添加量為2 μg/kg的加標樣品，平行按下列方法分別提?。悍椒?：加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈溶液提取；方法2：加入 10 mL乙腈提取；方法3：先加入10 mL水進行分散后，加入10 mL乙腈提取，使用5 g NaCl除水；方法4：按AOAC法，先加入10 mL水進行分散后，加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈提取后，使用4 g MgSO4+1 g NaCl除水；方法5：按CEN法，先加入10 mL水進行分散后，加入10 mL乙腈提取，加入除水緩沖鹽（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3Cit+0.5 g 2Na2HCit·1.5H2O），所得的提取液不經(jīng)凈化直接上機測定。4種化合物的回收率對比如圖2所示。

圖2 不同提取條件下各化合物提取效率的對比Fig.2 Comparison of analyte recoveries using different extraction methods

從圖2可以看出，使用QuEChERS法結(jié)合檸檬酸緩沖鹽體系的提取效率最佳，這可能是因為QuEChERS法對樣品的分散較好，另外，加入緩沖鹽能夠更加促進鹽析過程，使化合物分配向有機相移動，從而提高了提取效率。

2.2.2 凈化條件的選擇

雞蛋和雞肉等動物源性食品，主要含有大量脂肪、蛋白質(zhì)以及部分脂溶性基質(zhì)雜質(zhì)。通過基質(zhì)分散乙腈提取，可以除去蛋白質(zhì)的影響，冷凍離心過程可以去除脂肪的影響。針對其余痕量雜質(zhì)的影響和去除手段，實驗考察Waters Oasis PRiME HLB、Agilent EMR、Dikma ProElut PLS等凈化方式，取2 mL提取液通過PRiME柱和PLS柱，接收餾出液；取2 mL提取液與50 mg EMR混勻1 min。分別取0.5 mL凈化液于0.5 mL水混合后上機測定。從圖3可以看出，各凈化手段對目標化合物的回收率均無明顯影響，同時對比凈化前后的譜圖，未見有顯著雜峰對目標物有影響。采用基質(zhì)添加樣品（2 μg/kg），連續(xù)進樣后，未見響應(yīng)有明顯變化，因此，采用不凈化的方式，對提取液進行適當稀釋，并在滿足檢出限的前提下降低進樣量，以達到消除基質(zhì)干擾的目的。

圖3 不同凈化條件下各化合物回收率對比Fig.3 Comparison of analyte recoveries using different clean-up methods

2.3 方法驗證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

使用空白雞蛋和雞肉基質(zhì)，進行樣品前處理、得到空白基質(zhì)溶液。使用空白基質(zhì)溶液分別配制質(zhì)量濃度為0.5、1、2、10、20、50 ng/mL的系列基質(zhì)配制標準曲線和溶液標準曲線。按如下公式計算評價基質(zhì)對各化合物的基質(zhì)效應(yīng)[31]：

式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；A為溶液標準曲線的斜率；B為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率。

若ME＜1，則表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME＞1，則為基質(zhì)增強效應(yīng)。由表3可知，氟蟲腈在雞肉中有基質(zhì)抑制效應(yīng)，氟蟲腈砜在雞蛋中有增強效應(yīng)，其余基質(zhì)效應(yīng)不明顯，在測定中可選擇基質(zhì)加標標準曲線法定量。

表3 雞蛋和雞肉中各化合物的基質(zhì)效應(yīng)Table3 Matrix effects of chicken eggs and meat

2.3.2 線性及靈敏度檢測結(jié)果

取空白樣品，制作分別為1、2、5、10、20 μg/kg的基質(zhì)加標系列樣品，在上述條件下，各化合物的定量離子均能達到信噪比大于10 倍，參考歐盟有關(guān)氟蟲腈及其代謝物在雞蛋和雞肉中的限量值為5 μg/kg[13]，且GB 2763—2016中規(guī)定其殘留標志物為4 種化合物之和[12]，因此，將4 種化合物的定量限均定為1 μg/kg，檢出限為0.5 μg/kg。線性方程、決定系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限見表4。各化合物在1～100 μg/kg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 氟蟲腈及代謝物的線性方程、決定系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限、平均回收率（n= 6）及精密度數(shù)據(jù)Table4 Calibration equations, coefficients of determination, liner ranges, LODs, LOQs, average recoveries and precision (RSD, n = 6) for fipronil and metabolites

2.3.3 回收率和精密度實驗結(jié)果

取空白雞蛋和雞肉樣品，添加混合標準溶液后混合均勻，得到質(zhì)量濃度分別為1（定量限）、5（限量值）、10 μg/kg（兩倍限量值）3 個水平的基質(zhì)加標樣品，在優(yōu)化后的條件下測定目標化合物。每個水平平行測定6 次，如表4可知，使用所建立的方法定量測定氟蟲腈及代謝物，在雞蛋中平均回收率為93.6%～117.7%，相對標準偏差為8.5%～9.9%，在雞肉中平均回收率為87.6%～106.3%，相對標準偏差為3.6%～8.2%，參考GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F方法確認的技術(shù)要求中的相關(guān)內(nèi)容[32]，該方法滿足殘留檢測的要求。

2.4 實際樣品測定結(jié)果

隨機抽取市售雞蛋15 個、雞肉10 個。應(yīng)用建立的方法對樣品進行測定，結(jié)果如圖4所示，在某一雞蛋樣品中檢出氟蟲腈砜30.7 μg/kg。

圖4 雞蛋空白樣品和陽性樣品的定量離子提取離子流圖Fig.4 Quantitative extracted ion chromatograms of standard, blank and positive samples

3 結(jié) 論

本研究采用QuEChERS法提取，超高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，建立雞蛋、雞肉中及其3 種代謝物的同步測定方法。與標準方法及已有報道相比，本方法涵蓋了GB 2763—2016及歐盟限量規(guī)定中的氟蟲腈的全部殘留標志物檢測，并通過色譜條件優(yōu)化，稀釋進樣等手段，降低了基質(zhì)干擾，簡化了前處理耗時，達到了快速、準確、可靠的測定，為開展動物源性食品中相關(guān)農(nóng)藥殘留測定進行探索。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法回收率、精密度、線性、測定低限等均滿足殘留檢測方法確認的要求，適用于雞蛋、雞肉中氟蟲腈及代謝物的快速定量測定。