沈 飛，劉 瀟，裴 斐，李 彭，姜大峰，劉 琴

（1.江蘇高?，F(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南 250014）

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物，小麥及其制品的品質(zhì)優(yōu)劣對(duì)于食品安全至關(guān)重要。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，是主要由小麥赤霉病菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素，可引起人畜中毒、代謝紊亂，有明顯的致突性、致癌性[1]。近年來(lái)，小麥赤霉病在我國(guó)大規(guī)模爆發(fā)越來(lái)越頻繁，尤其對(duì)冬麥主產(chǎn)區(qū)造成重大危害，其產(chǎn)生的DON污染已成為小麥減產(chǎn)和品量變差的重要原因。加強(qiáng)小麥DON污染的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)是控制其危害的前提。目前，DON檢測(cè)方法有薄層層析法[2]、高效液相色譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]和酶聯(lián)免疫吸附法[6]等。這些方法檢測(cè)的準(zhǔn)確度普遍較高，但過(guò)程均較為復(fù)雜繁瑣，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際檢測(cè)需求。因此，開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的小麥及其制品DON污染檢測(cè)方法，對(duì)于建立健全DON污染監(jiān)測(cè)體系，維護(hù)食品安全和人民身心健康十分必要。

衰減全反射-傅里葉紅外光譜（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）是一種分子振動(dòng)光譜技術(shù)，它無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，能夠快速獲得樣品的光譜指紋特征，已成功用于食用油[7-8]、水果[9-12]、肉類[13-15]等食品/農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)與安全檢測(cè)中。在小麥及其制品研究方面，Kos等[16]利用ATR-FTIR對(duì)受DON污染的玉米進(jìn)行分析，結(jié)果表明DON含量在0.13～8.23 mg/kg范圍內(nèi)時(shí)，判別正確率為75%。Girolamo等[17]通過(guò)分析找到了DON所對(duì)應(yīng)的特征波長(zhǎng)，通過(guò)定性預(yù)判模型和偏最小二乘（partial least squares，PLS）法模型能夠判斷出小麥中DON含量的高低，但是該模型只適合于特定的小麥。關(guān)二旗等[18]利用近紅外光譜獲取赤霉病小麥碎粒和未感病小麥籽粒的近紅外光譜數(shù)據(jù)信息，構(gòu)建了SIMCA模型，實(shí)現(xiàn)了小麥赤霉病粒的準(zhǔn)確識(shí)別。但該研究中樣品量較小，結(jié)果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上可知，應(yīng)用光譜技術(shù)，尤其是ATRFTIR檢測(cè)小麥DON污染的研究還較為有限，對(duì)象多以小麥原糧為主，且主要集中在定性判別上。

本研究擬進(jìn)一步探索不同樣品基質(zhì)條件下ATR-FTIR技術(shù)的應(yīng)用潛力，建立小麥、面粉以及面粉制品中DON污染的快速分析方法和模型，為實(shí)現(xiàn)小麥DON污染的快速、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從農(nóng)戶、糧庫(kù)和超市等處搜集小麥（34 份）、面粉（34 份）以及餅干、面包等面粉制品（30 份）樣品，共98份。將收集的樣品全部磨成粉并過(guò)20 目篩，以保持樣品檢測(cè)狀態(tài)的一致性，放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

DON標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.5%） 美國(guó)Sigma公司；超純水（電阻≥18.2 MΩ）；乙腈、甲醇（均為色譜純）；其他所用試劑均為色譜純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Tensor27型FTIR儀 德國(guó)Bruker公司；ZnSe ATR附件 美國(guó)Pike公司。

1.3 方法

1.3.1 ATR-FTIR測(cè)量

將冷藏樣品置于室溫（23±1）℃平衡2 h，運(yùn)用FTIR儀和ZnSe ATR附件（采集樣品的光譜信息。用天平稱取1 g粉末樣品放于ATR 附件的ZnSe晶體上，以空氣背景進(jìn)行檢測(cè)，掃描波數(shù)范圍4 000～600 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描64 次，樣品重復(fù)掃描3次，取平均值作為樣品的光譜數(shù)據(jù)[19]。

1.3.2 DON含量測(cè)定

樣品中DON含量的測(cè)定綜合參考羅穎鵬[3]、王麗娟[20]等的方法，將所有樣品清雜后用粉碎機(jī)全部粉碎成粉（過(guò)20 目篩），準(zhǔn)確稱取25.0 g樣品到250 mL錐形瓶中，加入100 mL乙腈-水（84∶16，V/V）溶液，渦旋混勻1 min，振蕩提取30 min，在 10 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)MycoSep226凈化柱凈化。棄掉最先流出的2 mL凈化液，取5 mL凈化液40 ℃氮?dú)饬鞔蹈?，殘余物? mL含0.2%氨水的乙腈-水（10∶90，V/V）復(fù)溶，渦旋30 s。再用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，2 mL進(jìn)樣瓶收集濾液，高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。該方法的檢出限為1 μg/kg，樣品的加標(biāo)回收率為89.8%～107.96%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理軟件采用TQ Analyst v 8.6.12（Thermo Electron 公司，美國(guó)）軟件。運(yùn)用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析和逐步多元性回歸（stepwise multiple linear regression，SMLR）分析方法建立DON毒素定量預(yù)測(cè)模型，自變量為樣品的中紅外光譜信息，因變量為樣品中DON毒素含量，隨機(jī)地選取樣品的2/3作為建模集，1/3作為驗(yàn)證集。為消除來(lái)自高頻隨機(jī)噪聲、基線漂移、樣本不均勻等對(duì)建模帶來(lái)的影響，采用多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）以獲得較好的預(yù)測(cè)效果，在建模過(guò)程中采用留一交互驗(yàn)證的方法保證模型的穩(wěn)健性[21]。用模型決定系數(shù)（correlation coefficient of determination，R2）、建模均方根誤差（root mean squared error of calibration，RMSEC）、預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean squared error of prediction，RMSEP）、交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean squared error of cross validation，RMSECV）和相對(duì)分析偏差（residual predictive deviation，RPD）[22]以及模型檢測(cè)限[23]等指標(biāo)對(duì)模型性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATR-FTIR分析

圖1 不同DON含量樣品的中FTIR圖Fig.1 FTIR spectra of samples with different DON contents

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮刀菌（F. culmorum）和串珠鐮刀菌（F. moniliforme）等鐮刀菌感染引起的[24]，而鐮刀菌所產(chǎn)毒素主要為DON。研究表明[25]由于鐮刀菌的呼吸作用會(huì)分解大分子物質(zhì)，當(dāng)小麥中DON含量增加時(shí)，淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪會(huì)發(fā)生不同程度的變化，同時(shí)鐮刀菌產(chǎn)生的DON會(huì)進(jìn)入淀粉和蛋白質(zhì)中從而導(dǎo)致淀粉和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合變疏松，進(jìn)而導(dǎo)致粗淀粉和粗蛋白的含量降低；鐮刀菌的生長(zhǎng)需要消耗能量，同時(shí)導(dǎo)致脂肪的氧化，故粗脂肪的含量逐漸下降，脂肪酸值在逐漸上升[26]。

檢測(cè)結(jié)果顯示，9 8 份樣品中D O N的含量在0.02～4.53 mg/kg之間，平均值為1.93 mg/kg。圖1a為不同DON含量小麥的ATR-FTIR的光譜圖，整體來(lái)看，樣品在4 000～600 cm－1范圍內(nèi)的中紅外譜圖比較相似，存在較多的共同譜峰。DON含量低的樣品的吸收值總體上略高于DON含量高的樣品。由圖1b可知，在1 740 cm－1處DON含量低的樣品的吸收值明顯高于DON含量高的樣品，鐮刀菌在產(chǎn)DON毒素的過(guò)程中能夠促進(jìn)脂肪的氧化，從而使得脂肪酸值上升；在1 648 cm－1（酰胺I）和1 549 cm－1（酰胺II）處有較明顯的吸收峰且DON含量高的樣品吸收值要高于含量低的，這主要是由于黃色鐮刀菌產(chǎn)生的蛋白酶能夠水解小麥中的蛋白質(zhì)生成氨基酸[27-28]。在1 300～900 cm－1波數(shù)處主要是由淀粉吸收鍵的振動(dòng)引起的，鐮刀菌在產(chǎn)DON毒素的過(guò)程中需要消耗能量，主要是通過(guò)水解淀粉等糖類物質(zhì)為其生長(zhǎng)代謝提供能量[29]。分析發(fā)現(xiàn)，樣品在1 900～900 cm－1波段范圍內(nèi)光譜差異較為顯著，因此用于后續(xù)分析。

2.2 PLSR建模分析

在PLSR分析過(guò)程中，為了進(jìn)一步對(duì)獲取光譜進(jìn)行分析，對(duì)所有樣品的前3 個(gè)PLS因子的潛變量（latent variable，LV）進(jìn)行權(quán)重分析，結(jié)果如圖2所示。LV1的最高權(quán)重位于1 745、1 657、1 475 cm－1和1 180 cm－1處，主要由脂質(zhì)、脂肪酸和蛋白質(zhì)引起的。鐮刀菌產(chǎn)DON過(guò)程中，樣品中的脂肪氧化產(chǎn)生脂肪酸，由于脂肪酸中C=O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)導(dǎo)致光譜在1 745 cm－1出現(xiàn)較強(qiáng)的峰；其中氨基酸中的COO的伸縮振動(dòng)會(huì)在1 600～1 555 cm－1附近出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收帶，蛋白質(zhì)分子中的—CO—NH—基團(tuán)的C—N伸縮振動(dòng)和C—N—H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)之間產(chǎn)生耦合，分別在1 640 cm－1和1 540 cm－1附近出現(xiàn)特征峰。LV2最高權(quán)重位于984 cm－1處，主要是由糖類引起的；LV3的最高權(quán)重位于1 545、1 385、1 088、1 046 cm－1和989 cm－1處，主要是由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及糖類引起的。由于糖類中含有多個(gè)的C—OH，而C—OH伸縮振動(dòng)會(huì)使光譜在1 100～1 000 cm－1附近出現(xiàn)多個(gè)吸收峰[30-31]。

圖2 用于DON分析的PLSR模型前3 個(gè)因子的權(quán)重光譜Fig.2 Loading spectra of the first three factors for DON analysis by PLSR model

利用PLSR對(duì)小麥及其制品中DON含量進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，從而判斷小麥及其制品的食用安全狀況。利用ATRFTIR對(duì)DON毒素含量進(jìn)行建模時(shí)，采用4 種不同的預(yù)處理方法對(duì)采集的原始光譜進(jìn)行處理，結(jié)果如表1所示，僅用MSC預(yù)處理光譜時(shí)，可獲得較高的RC2和較低的RMSEC，且RMSECV與RMSEP值均較小。此外，RPD值在2～2.5之間說(shuō)明模型具有定量預(yù)測(cè)的潛能，在2.5～3之間說(shuō)明模型用于定量分析，大于3時(shí)，表示模型預(yù)測(cè)精度高、可用于實(shí)際定量分析[32]。如表1所示，MSC預(yù)處理PLSR模型的RPD值達(dá)到2.6，定量分析的檢測(cè)限為1.435 mg/kg，表明模型在快速篩分及定量檢測(cè)方面具有一定的實(shí)際應(yīng)用潛力。

表1 小麥及其制品中DON含量的PLSR定量分析結(jié)果Table1 PLSR prediction of DON contamination in wheat and its products

2.3 SMLR建模分析

表2 小麥及其制品中DON含量的SMLR定量分析結(jié)果Table2 SMLR prediction of DON contamination in wheat and its products

SMLR可以對(duì)自變量進(jìn)行篩選，剔除不具備顯著性意義的變量，從而確定一個(gè)最佳的線性回歸方程。利用SMLR進(jìn)行預(yù)測(cè)分析時(shí)分別選擇7、9、11 個(gè)和13 個(gè)波段數(shù)進(jìn)行分析，分析前運(yùn)用MSC對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，建模時(shí)所選取波段中有些與DON產(chǎn)生有關(guān)，有些與DON的產(chǎn)生存在間接的聯(lián)系。在所選的13 個(gè)波段中，1 537、1 562、1 600、1 680 cm－1和1 677 cm－1均是蛋白質(zhì)的特征吸收峰；1 525、1 507 cm－1和1 479 cm－1為脂肪的特征吸收峰；1 073、1 083 cm－1和1 027 cm－1處為淀粉的特征吸收峰；1 785 cm－1為脂肪酸特征吸收峰；而1 824 cm－1吸收值很小，可能為噪聲等雜峰。而DON的產(chǎn)生主要與淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪相關(guān)，所以通過(guò)波段的選擇可以提高預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。建模結(jié)果顯示，所選波段數(shù)為9 個(gè)和13 個(gè)時(shí)，建模效果較其他兩組要好。評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型的優(yōu)劣主要是通過(guò)、RMSEP值評(píng)價(jià)，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)在選取9 個(gè)和13 個(gè)波段進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)效果較好。通過(guò)斜率和截距的大小也能反映出線性模型效果的優(yōu)劣，斜率越接近1，截距越接近0表明線性相關(guān)性越好。對(duì)比9 個(gè)波段和13 個(gè)波段的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選取9 個(gè)波段進(jìn)行分析時(shí)相關(guān)性較好，斜率和截距分別為0.940 2和0.166 6，此時(shí)模型的RPD值為2.6，檢測(cè)限為1.50 mg/kg。

圖3 小麥及其制品DON毒素含量的PLSR（a）和SMLR（b）模型預(yù)測(cè)結(jié)果圖Fig.3 Predictive models for wheat and its products by PLSR (a) and SMLR (b)

利用PLSR和SMLR對(duì)小麥、面粉以及小麥制品建立分析預(yù)測(cè)模型。全部樣品的PLSR模型預(yù)測(cè)結(jié)果見圖3a，所有樣品都分布于中心線兩側(cè)，共8 個(gè)因子用于計(jì)算，預(yù)測(cè)集的值為0.86，RMSECV與RPD值分別為0.507 mg/kg、2.6。圖3b為選取9 個(gè)波段時(shí)的SMLR模型，預(yù)測(cè)集的值為0.86，RMSECV與RPD值分別為0.495 mg/kg、2.6，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示通過(guò)PLSR和SMLR建?？深A(yù)測(cè)小麥、面粉及其他小麥制品中的DON含量。

PLSR是對(duì)全光譜進(jìn)行建模分析的，數(shù)據(jù)矩陣分解和回歸交互結(jié)合，得到的特征向量直接與樣品性質(zhì)相關(guān)，故所建模型一般較為穩(wěn)健。但由于選取的光譜范圍內(nèi)存在干擾峰并且存在低含量的樣品預(yù)測(cè)誤差大的缺點(diǎn)，所以實(shí)際應(yīng)用時(shí)利用PLSR模型對(duì)DON低于其檢測(cè)限的樣品進(jìn)行分析時(shí)的效果可能不佳。SMLR是隨機(jī)選取多個(gè)譜帶進(jìn)行分析，在分析的過(guò)程中將干擾峰和噪音峰剔除，但由于選擇譜帶的隨機(jī)性，有些譜帶與DON的產(chǎn)生存在直接的關(guān)系，有些則無(wú)關(guān)，所以可能導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)性能下降。

3 結(jié) 論

本研究表明ATR-FTIR技術(shù)可作為一種快速分析方法，評(píng)估小麥及其制品的DON污染情況。研究表明，不同DON含量樣品在1 740、1 648、1 549 cm－1等附近的吸收值存在顯著差異，可作為DON定量檢測(cè)的指紋圖譜加以利用。PLSR和SMLR的模型結(jié)果預(yù)測(cè)誤差較低，RMSEP分別為0.438 mg/kg和0.426 mg/kg，RPD值均為2.6，具有一定的實(shí)際應(yīng)用潛力。然而，本研究所用樣品數(shù)量仍較為有限，進(jìn)一步研究需要補(bǔ)充更多的代表性樣品，以不斷增強(qiáng)模型的穩(wěn)健性和適用性。