單 藝，王象欣，陳美君，姜毓君,3，滿朝新,3，馬 微

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.食品安全和營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150028；4.東寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 東寧 157200）

三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲這4 種含氮量較高且性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉的化合物被稱作偽蛋白。添加到乳制品中使得蛋白質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于其實(shí)際含量，從而提高乳制品的附加值。同時(shí)，這類偽蛋白可作為動(dòng)植物飼料，被廣泛的應(yīng)用于反芻動(dòng)物飼養(yǎng)以及草場肥料等方面，也大大增加了其進(jìn)入乳制品中的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害人類健康[1-3]，阻礙企業(yè)乃至行業(yè)的生存發(fā)展[4]。目前食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的蛋白質(zhì)測定方法為凱氏定氮法，該法通過測定氮元素的含量間接對(duì)食品中蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，而不是測定蛋白質(zhì)的真實(shí)值。

根據(jù)衛(wèi)生部等5個(gè)部門關(guān)于三聚氰胺在食品中的限量值的公告（2011年第10號(hào)），我國對(duì)嬰幼兒配方粉中三聚氰胺的最高殘留限量為1 mg/kg。美國和歐盟各國規(guī)定了環(huán)丙氨嗪在畜產(chǎn)品中的最高殘留限量為0.05 mg/kg[5]。尚未對(duì)食品中的雙氰胺和縮二脲進(jìn)行限量，但高劑量攝入可能對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[6-7]。目前測定三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲的方法主要有離子色譜法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、液相色譜法[10-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[14-18]等。對(duì)于乳制品這種復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析，對(duì)目標(biāo)化合物的提取主要有固相萃取法[19]、液液萃取法[20-21]等，由于以上4 種化合物性質(zhì)不盡相同，固相萃取法同時(shí)凈化比較困難，液液萃取法凈化效果一般，基質(zhì)效應(yīng)改善不明顯，操作較復(fù)雜。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是對(duì)印記分子及其結(jié)構(gòu)類似的客體分子具有特異選擇性和識(shí)別能力的高分子功能材料，具有抗干擾性強(qiáng)、選擇性高、穩(wěn)定性好、使用壽命長等特點(diǎn)，適用于復(fù)雜樣品的前處理[22]。近年來，磁性納米粒子由于具有較大的表面積和獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，將其與MIPs相結(jié)合制備成磁性分子印跡聚合物（magnetic molecularly imprinted polymers，MMIPs），MMIPs在完成對(duì)目標(biāo)化合物的特異性識(shí)別、吸附后，只需在外加磁場的條件下即可實(shí)現(xiàn)與溶液的分離。其操作簡單且分離時(shí)間短，使得分子印跡技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域得到進(jìn)一步的發(fā)展。MMIPs作為一種新型的功能性材料，被廣泛應(yīng)用到細(xì)胞學(xué)、生物工程、生物醫(yī)藥和食品或環(huán)境中有害物質(zhì)富集檢測等領(lǐng)域[23-29]。

本實(shí)驗(yàn)利用磁性分子印跡技術(shù)，以縮二脲-13C2和環(huán)丙氨嗪-D4為模板分子，F(xiàn)e3O4為磁性納米顆粒，制備對(duì)三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲具有特異性識(shí)別的MMIPs。MMIPs結(jié)合同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)現(xiàn)乳及乳制品中偽蛋白的特異性分離、富集和定性及定量分析。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確度高，為磁性分子印跡技術(shù)在乳制品檢測中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液態(tài)奶、酸奶、乳飲料等30 種乳制品 市購。

氯化鐵、硫酸鐵、氨水、油酸、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）、偶氮二異丁腈（azodiisobutyronitrile，AIBN）（均為優(yōu)級(jí)醇），雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、縮二脲標(biāo)準(zhǔn)品、縮二脲-13C2內(nèi)標(biāo)（C）、三聚氰胺-三胺-15N3內(nèi)標(biāo)（）（純度均為99.0%） 美國Sigma-Aldrich公司；聚乙二醇6000（polyethylene glycol，PEG-6000）（分析純） 西隴化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）、環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%） 美國Fluka公司；環(huán)丙氨嗪-D4（C6H6N6D4，純度99.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司。實(shí)驗(yàn)用水為電阻率18.2 MΩ·cm去離子水，由Milli-Q超純水儀提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Mass LynxTM色譜工作站 美國Waters公司；QGC-12T干熱式氮吹儀 上海泉島科貿(mào)有限公司；BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；MARS 6微波消解儀、聚四氟乙烯XP55T高壓反應(yīng)罐 美國CEM公司。

1.3 方法

1.3.1 表面修飾Fe3O4磁流體納米顆粒的制備

利用共同沉淀法制備Fe3O4顆粒[30]。將含有FeCl3（2.0 mol/L）和FeSO4（1.0 mol/L）的混合溶液加熱至50 ℃，加入氨水直到溶液pH 9，此時(shí)可見溶液中的Fe3O4深褐色沉淀。靜置一段時(shí)間，移去上層清液。取出每份約8 mL的Fe3O4放入微波消解罐中，沖入氮?dú)猓瑪Q緊旋蓋放入微波消解儀，800 W、70 ℃熟化30 min。冷卻到室溫后，將最終的黑色沉淀進(jìn)行減壓抽濾，用去離子水及10%乙酸反復(fù)洗滌，去除表面的雜質(zhì)。取大約2 g制備的Fe3O4顆粒，加入約40 mL去氧水，在氮?dú)獗Ｗo(hù)、80 ℃條件下加入油酸2 mL，反應(yīng)30 min使Fe3O4充分被油酸包裹，降溫至約50 ℃，加入PEG-6000 10.0 g，超聲15 min，稀釋至100 mL，冷卻后即得到穩(wěn)定的表面修飾Fe3O4磁流體納米顆粒。

1.3.2 MMIPs的制備

1.0 mmol縮二脲-13C2溶于20 mL甲醇-水（1∶1，V/V）溶液中，再加入6 mmol MAA攪拌30 min，得到縮二脲-13C2與功能單體的復(fù)合物溶液；再加入20 mmol EGDMA和1.3.1節(jié)制備的1 g Fe3O4磁流體納米顆粒，超聲30 min得到預(yù)聚合復(fù)合物溶液。0.4 g PVP溶于100 mL乙醇中，溶解后充入氮?dú)猓瑫r(shí)加熱至60 ℃。加入上述聚合復(fù)合物溶液和0.1 g AIBN，在60 ℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24 h。冷卻后在外部磁場作用下將聚合物與溶液分離，分別用去離子水、甲醇-乙酸（8∶2，V/V）溶液沖洗，直到洗脫液用液相色譜-質(zhì)譜檢測不到縮二脲-13C2（印跡分子）。然后將此聚合物用水沖洗，在60 ℃條件下干燥，制得可同時(shí)吸附雙氰胺、縮二脲的MMIPs微球1-MMIPs[31-33]。

1.0 mmol環(huán)丙氨嗪-D4溶于20 mL甲醇-水（1∶1，V/V）溶液中，再加入8 mmol MAA，攪拌30 min，得到環(huán)丙氨嗪-D4與功能單體的復(fù)合物溶液；再按照上述步驟完成聚合反應(yīng)，制得可同時(shí)吸附三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪的MMIPs微球2-MMIPs[33]。

1.3.3 色譜條件

A C Q U I T Y U P L C B E H A m i d e色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為含1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫：0～2 min，3% A；2～3.2 min，3%～20% A；3.2～4.2 min，20%～30% A；4.2～4.5 min，30%～3% A；4.5～7 min，3% A。流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；樣品室溫度20 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；毛細(xì)管電壓0.5 kV；離子源溫度120 ℃；去溶劑氣溫度400 ℃；去溶劑氣流速900 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞氣體為氬氣，碰撞氣流速0.24 mL/min；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式；質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)條件Table1 Mass spectrometric conditions of multiple reaction monitoring (MRM)

1.3.5 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別將雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、縮二脲標(biāo)準(zhǔn)品、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)品、三聚氰胺-三胺-15N3內(nèi)標(biāo)物用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液配制成1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，－18 ℃避光冷藏保存。臨用時(shí)，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液逐級(jí)稀釋雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成所需的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液以空白樣品提取液稀釋配制，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液定容前需加入適量三聚氰胺-三胺-15N3內(nèi)標(biāo)物，使三聚氰胺-三胺-15N3內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為1 μg/mL。

1.3.6 樣品制備過程

液態(tài)奶、酸奶、乳飲料等樣品，準(zhǔn)確稱取12.5 g于三角瓶中；奶粉樣品，準(zhǔn)確稱取2.0 g于三角瓶中，加入12.5 mL水溶解，加入12.5 mL乙腈，超聲提取30 min。加入50 μL 1 000 μg/mL的三聚氰胺-三胺-15N3內(nèi)標(biāo)溶液，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液定容至50 mL，搖勻，濾紙過濾。稱取150 mg MMIPs于燒杯中，按順序加入4 mL甲醇，4 mL去離子水，攪拌活化。在外部磁場作用下使MMIPs與液體分離，并棄去液體。加入15 mL去離子水，3 mL樣品濾液，此混合液體攪拌6 min，使目標(biāo)化合物被MMIPs吸附。在外磁場作用下使MMIPs與溶液分離，棄去上層液體后，用3 mL 20%甲醇溶液清洗MMIPs表面。用甲醇-乙酸（95∶5，V/V）溶液洗脫被MMIPs吸附的目標(biāo)化合物。加入1 mL甲醇-乙酸（95∶5，V/V）溶液，超聲1 min，在外磁場作用下使MMIPs與溶液分離，收集液體，此操作重復(fù)6 次。6 次的洗脫液合并后約6 mL，在50 ℃氮?dú)獯蹈珊?，加?.0 mL流動(dòng)相A溶解殘?jiān)?，過0.22 μm濾膜后上機(jī)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 MMIPs的合成與分子識(shí)別

圖1 表面修飾Fe3O4磁流體納米顆粒在外部磁場作用下的磁分離Fig.1 Magnetic separation of surface modified Fe3O4 nanoparticles

本實(shí)驗(yàn)利用共沉淀法制備磁性Fe3O4納米微球，與傳統(tǒng)方法相比，采用微波進(jìn)行熟化處理使得Fe3O4結(jié)晶程度提高；加入油酸和PEG-6000對(duì)其進(jìn)行包裹，PEG-6000的疏水端和油酸的疏水端形成雙層膠束，使磁性粒子能很好地分散在溶液中。添加PVP使Fe3O4納米顆粒在水中洗滌幾次或強(qiáng)力攪拌后仍能長時(shí)間穩(wěn)定分散，并且放置4 個(gè)月以上沒有沉淀產(chǎn)生[34]。如圖1所示，在外磁場作用下偽蛋白磁性印跡聚合物迅速吸附沉降，具有很好的磁敏感性。由于三聚氰胺與環(huán)丙氨嗪有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，縮二脲與雙氰胺也有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)選擇環(huán)丙氨嗪和縮二脲的2 種同位素，即環(huán)丙氨嗪-D4和縮二脲-13C2作為模擬印跡分子合成MMIPs，可以對(duì)4 種化合物進(jìn)行特異性吸附，避免了4 種化合物之間的測定干擾[35]。

制備MMIPs時(shí)，功能單體的選擇、功能單體與印跡分子的配比都至關(guān)重要。堿性印跡分子常選用酸性功能單體，因此本實(shí)驗(yàn)在制備MMIPs時(shí)，選用酸性功能單體MAA。印跡分子與功能單體MAA混合，它們之間通過氫鍵作用形成功能單體-印跡分子復(fù)合物。將形成的單體-印跡分子復(fù)合物、交聯(lián)劑EGDMA和表面修飾Fe3O4磁流體納米顆粒混合，在引發(fā)劑AIBN的作用下采用熱引發(fā)方式將單體-印跡分子復(fù)合物、交聯(lián)劑EGDMA和Fe3O4磁流體納米顆粒聚合，形成高聚物。最后，將三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲印跡分子從高聚物中洗脫出來，這樣高聚物上就留出與印跡分子形狀、大小完全相同且具有特異識(shí)別性的孔穴。分析物中的印跡分子與高聚物上的孔穴有特異性的吸附作用，從而達(dá)到將目標(biāo)物從待測物中分離的目的，見圖2。

圖2 MMIPs合成示意圖Fig.2 Synthesis route of MMIPs

2.2 MMIPs吸附性能的測定

圖3 4 種偽蛋白吸附等溫曲線Fig.3 Binding isotherms of MMIPs and MNIP

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)考察MMIPs對(duì)雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪的吸附能力。制備磁性非分子印跡聚合物（magnetic non-molecular imprinted polymers，MNIP）時(shí)，除不加印跡分子外，其余步驟同1.3.2節(jié)。由圖3可知，隨著平衡濃度的增加，4 種偽蛋白被MMIPs吸附的含量顯著增加，MMIPs對(duì)雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪均具有較好的特異性吸附能力。MMIPs和MNIP對(duì)4 種偽蛋白的吸附量具有顯著差異。這是由于MMIPs中形成了帶有與印記分子互補(bǔ)且空間上固定排列的分子印跡位點(diǎn)，當(dāng)印記分子進(jìn)入“孔穴”中時(shí)，與其中的官能團(tuán)發(fā)生對(duì)應(yīng)的結(jié)合作用，能夠更好地吸附目標(biāo)分子。而對(duì)于MNIP來說，由于不具有特異性的印跡位點(diǎn)，其與底物產(chǎn)生結(jié)合作用屬于物理吸附，無規(guī)律性，所以MNIP的吸附量變化不顯著。

2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件的選擇

雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪均屬于分子結(jié)構(gòu)帶有氨基的有機(jī)胺類強(qiáng)極性化合物，所以使用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，親水相互作用色譜模式（HILIC模式）對(duì)其進(jìn)行分離。電噴霧電離模式為正離子模式，故在流動(dòng)相中加入甲酸加強(qiáng)目標(biāo)化合物的質(zhì)子化效果。但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸和乙腈作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫時(shí)化合物峰形和線性關(guān)系均不理想，分析原因或?yàn)榱鲃?dòng)相pH值過低，因此在流動(dòng)相中引入緩沖鹽，使其保持相對(duì)穩(wěn)定的酸度。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用含1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨溶液和乙腈對(duì)待測物進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，線性關(guān)系良好、峰形明顯改善。

根據(jù)歐盟非強(qiáng)制執(zhí)行法案2002-657-EC[36]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行物質(zhì)鑒定時(shí)，物質(zhì)的確認(rèn)需要最少4 個(gè)識(shí)別點(diǎn)。采用多離子反應(yīng)監(jiān)控模式，1 個(gè)母離子（1 個(gè)識(shí)別點(diǎn)），2 個(gè)子離子（每個(gè)1.5 個(gè)識(shí)別點(diǎn)），滿足法案要求。因?yàn)? 種化合物均含堿性基團(tuán)氨基，理論上在電噴霧離子源正離子模式下更易得到較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子信號(hào)，實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了4 種化合物在電噴霧離子源正離子模式條件下[M+H]+信號(hào)最強(qiáng)。所以本實(shí)驗(yàn)采用正離子掃描，[M+H]+作為準(zhǔn)分子離子峰（表1）。為了提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，選用三聚氰胺-三胺-15N3作為內(nèi)標(biāo)化合物來校正由于樣品基體的干擾所帶來的質(zhì)譜信號(hào)的偏離，由于均屬于帶有氨基的有機(jī)胺類化合物，可以最大限度地減少分析誤差。標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖和的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖4。

圖4 多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖和的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 MRM chromatograms and tandem mass spectra

2.4 提取條件的優(yōu)化

2.4.1 提取方式

雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪均微溶于水，可溶于乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑中，直接加入2 種MMIPs進(jìn)行吸附，乳制品中大量的蛋白均會(huì)覆蓋2 種MMIPs的表面，會(huì)影響2 種MMIPs對(duì)目標(biāo)化合物的吸附。故選擇乙腈-水（50∶50，V/V）預(yù)先除去大部分蛋白，再加入2 種MMIPs進(jìn)行特異性吸附。

2.4.2 MMIPs的用量

在上述提取液（雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪含量均為1 μg）中分別加入20、40、60、80、100、120、150、180、200 mg MMIPs，吸附完成后按照1.3.6節(jié)方法處理。結(jié)果顯示，當(dāng)2 種MMIPs添加量在20～150 mg時(shí)，4 種化合物的回收率均隨著MMIPs添加量的增加而增加；當(dāng)2 種MMIPs添加量大于150 mg時(shí)，4 種化合物的回收率不再增加。此4 種化合物的最小回收率為95.2%。由此得出添加150 mg 2 種MMIPs完全滿足樣品測定的需要。

2.4.3 提取時(shí)間的選擇

對(duì)不同吸附時(shí)間（1～15 min）的4 種化合物的回收率進(jìn)行測定。當(dāng)吸附時(shí)間在1～6 min時(shí)，此4 種化合物的平均回收率從35.1%增加到95.1%，當(dāng)吸附時(shí)間大于6 min時(shí)，此4 種化合物的平均回收率沒有顯著增加，所以確定最佳吸附時(shí)間為6 min。

2.4.4 清洗溶劑的選擇

MMIPs吸附完成后首先需要清洗MMIPs表面雜質(zhì)，然后將印跡孔穴中的目標(biāo)化合物洗脫出來?？疾觳煌w積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液以及乙腈溶液，分別對(duì)MMIPs表面進(jìn)行清洗，并對(duì)洗脫溶劑的體積進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，使用3 mL 10%甲醇溶液對(duì)MMIPs表面進(jìn)行清洗，4 種化合物回收率均比較高。

2.4.5 洗脫溶劑的選擇

目標(biāo)化合物（印跡分子）以較弱的氫鍵或離子作用等非共價(jià)鍵與MMIPs中的特異性空穴結(jié)合。一般采用乙腈、水、甲醇-乙酸、乙腈-乙酸等相對(duì)高極性溶劑反復(fù)洗脫，即可除去印跡分子。經(jīng)過比較實(shí)驗(yàn)，本方法加入1 mL甲醇-乙酸（95∶5，V/V）溶液對(duì)4 種化合物進(jìn)行洗脫，反復(fù)6 次。為了提高提取效率，洗脫時(shí)使用超聲波進(jìn)行輔助提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用該洗脫方式，4 種目標(biāo)化合物均可被完全洗脫。

2.5 樣品基質(zhì)效應(yīng)

為保證方法的通用性和適用性，本實(shí)驗(yàn)研究基質(zhì)對(duì)分析物信號(hào)的影響，以消除干擾。在乳制品中，由于配方復(fù)雜且蛋白質(zhì)等物質(zhì)的存在，離子抑制十分明顯。經(jīng)研究采用MMIPs進(jìn)行凈化排除干擾物質(zhì)，并結(jié)合清洗和洗脫，同時(shí)添加同位素內(nèi)標(biāo)抵消質(zhì)譜離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，從而消除了基質(zhì)效應(yīng)，乳粉加標(biāo)樣品的色譜圖見圖5。

圖5 乳粉加標(biāo)樣品提取離子色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatogram of spiked milk powder sample

2.6 線性范圍及檢出限測定結(jié)果

按照1.3.5節(jié)方法配制一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用添加同位素內(nèi)標(biāo)物和空白樣品提取液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作液2 種方式相結(jié)合來減弱離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，減小定量結(jié)果的偏差[17]。在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以待測物質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲4 種偽蛋白各自的質(zhì)量濃度與相應(yīng)的峰面積比值（偽蛋白峰的面積/三聚氰胺-三胺-15N3峰面積）呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999 0以上。

以1.3.6節(jié)方法處理添加目標(biāo)化合物的空白樣品，按照選定的色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，以3 倍信噪比為方法檢出限，以10 倍信噪比為方法定量限。其中檢出限1與定量限1為固體樣品的檢出限與定量限，檢出限2與定量限2為液體樣品的檢出限與定量限，見表2。

表2 方法的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table2 Linear equation, linear range, correlation coefficient, LOD and LOQ of the method

2.7 回收率和精密度測定結(jié)果

在不同種類的空白乳制品中添加不同水平的雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其回收率、精密度結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，雙氰胺的平均加標(biāo)回收率為82.8%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～9.2%；縮二脲的平均加標(biāo)回收率為80.5%～94.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～7.2%；三聚氰胺的平均加標(biāo)回收率為88.6%～95.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～6.9%；環(huán)丙氨嗪的平均加標(biāo)回收率為83.5%～96.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～7.5%。

表3 不同乳制品中回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table3 Recovery and precision for 6 replicate determinations of four pseudo proteins in different samples (n= 6)

2.8 實(shí)際樣品測定結(jié)果

對(duì)市售的30 種乳制品進(jìn)行分析測定，利用本方法對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次，結(jié)果表明三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲含量均小于方法檢出限。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以縮二脲-13C2和環(huán)丙氨嗪-D4為印記分子，MAA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，F(xiàn)e3O4為磁性組分成功制備出對(duì)三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲有特異選擇吸附性能MMIPs。此外，該聚合物具有很好的磁性，在完成對(duì)目標(biāo)物的吸附后，可以在外加磁場作用下實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)快速分離，使提取過程更加方便、快捷。應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)提取出來的三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲進(jìn)行色譜分離、定性、定量分析，其結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。