肖力源，張淑瑤，周湘媛，周筱三，吳賀君，黎杉珊，申光輝，張志清

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

針對合成包裝材料生物降解性差、污染環(huán)境等問題，近年來研究人員對多糖類生物降解涂層或包裝材料進行了廣泛研究[1]。為防止食源性致病菌等造成食品腐敗變質(zhì)，人們向生物降解材料中添加天然抗菌劑制備活性包裝，可以減少食品防腐劑的使用和延長食品保質(zhì)期[2]。淀粉因其可生物降解、價格低廉和來源豐富已被用作生物降解塑料生產(chǎn)的原料。

植物精油來源天然、安全無毒，被美國食品藥品監(jiān)督管理局列為公認安全使用物，并被批準(zhǔn)為食品添加劑[3]。研究發(fā)現(xiàn)植物精油可以抑制或延緩致病微生物的生長。李文茹等[4]研究肉桂、山蒼子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜6 種植物精油對黑曲霉、繩狀青霉、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抗菌效果，發(fā)現(xiàn)肉桂精油的抗真菌和細菌活性最強，植物精油因化學(xué)成分不同抗真菌、細菌活性效果也會不同。另一方面，將植物精油添加在生物降解材料中其抗菌活性可在其中表達，但會影響聚合物的物理性能。Ghasemlou等[5]研究發(fā)現(xiàn)加入百里香和唇萼薄荷精油可改善玉米淀粉膜的斷裂伸長率和水蒸氣透過率，使膜顏色偏黃，2 種膜都顯示出抗菌活性；Seydim等[6]將牛至、迷迭香和大蒜精油添加于乳清分離蛋白膜中，發(fā)現(xiàn)添加2%牛至精油和添加量大于3%的大蒜精油的膜有抑菌效果（P＜0.05），而添加迷迭香精油的膜沒有顯示任何抗菌活性。玉米淀粉基質(zhì)膜是多糖生物降解材料中研究相對較多、也比較早的膜。但抗菌精油與玉米淀粉、殼聚糖和魔芋葡甘露聚糖等配合制備抗菌膜鮮見報道。

本研究選擇牛至精油、百里香精油、迷迭香精油和肉桂精油，研究其對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的大腸桿菌及沙門菌的抗菌活性，在以玉米淀粉、殼聚糖和魔芋葡甘露聚糖為成膜基材，甘油為增塑劑，吐溫-80為表面活性劑的基礎(chǔ)上，通過篩選添加最優(yōu)抗菌性的植物精油，研究抗菌劑添加量對復(fù)合膜機械性能、阻水性、光學(xué)性能的影響，并通過抑菌圈法研究復(fù)合膜對3 種菌的抗菌效果，為開發(fā)應(yīng)用新型抗菌降解包裝技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉 重慶佳仙食品有限公司；殼聚糖（生物試劑，脫乙酰度90%） 上海源葉生物科技有限公司；魔芋葡甘露聚糖 成都光禾商貿(mào)有限公司；丙三醇、冰乙酸、吐溫-80、氯化鈉（均為分析純），瓊脂粉（生物試劑） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；牛至精油、百里香精油、迷迭香精油、肉桂精油 吉安盛大香料油有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生物試劑）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、大腸桿菌（ATCC25922）、沙門菌（ATCC8389） 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

Sartorius CP225D型電子天平 德國賽多利斯公司；UV-3100紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；PERME W3/031水蒸氣透過率測試儀 濟南蘭光機電技術(shù)有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 超技儀器有限公司；YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZWY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；SC-10便攜式色差儀 蘇州欣美和儀器有限公司；FJ200-SH數(shù)顯恒速高速分散均質(zhì)機 上海壘固儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市英峪華科儀器廠；HWS28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HD-E702-100型恒溫恒濕箱 海達國際儀器有限公司；79-1磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；148-121型螺旋測微器 鄭州中天實驗儀器有限公司；數(shù)顯游標(biāo)卡尺（0～150 mm） 世達工具（上海）有限公司；玻璃成膜板（內(nèi)腔23 cm×28 cm） 自制。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與菌懸液制備

分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌斜面培養(yǎng)活化2 次，從活化2 次斜面培養(yǎng)基上取1 菌環(huán)量菌種接種到100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，于37 ℃、200 次/min振蕩培養(yǎng)24 h后，10 倍梯度稀釋，取濃度106CFU/mL菌懸液備用[7]。

1.3.2 精油最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定

將牛至精油、百里香精油、迷迭香精油和肉桂精油分別先用60%乙醇溶液定容至800 mg/mL，采用雙倍稀釋法[8]稍作修改。標(biāo)號試管1～11，每管加入1 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，取1 mL精油加入第1管中，之后連續(xù)雙倍稀釋8 管，從第9管移除1 mL。每管接入1 mL實驗菌懸液，渦旋混勻，最終各管含菌量為105～106CFU/mL，每種植物精油質(zhì)量濃度最終分別為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL。37 ℃培養(yǎng)24 h，從各管中取出培養(yǎng)液100 μL，涂布平板培養(yǎng)24 h后觀察。若有菌落生長，記為陽性（+）；若無菌落生長，記為陰性（－）。無細菌生長的精油最低濃度即為MIC。以不添加乙醇和精油的10號試管為空白對照，以僅添加1 mL 60%乙醇溶液的11號試管為陰性對照，每種處理做3 個平行樣。在測出MIC的基礎(chǔ)上，從無菌生長的試管中取出100 μL培養(yǎng)液加入到10 mL營養(yǎng)肉湯中稀釋混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板涂布觀察有無細菌生長，無菌生長的最小濃度即為MBC。陰性和空白對照同MIC標(biāo)號組，每種處理做3 個平行[9]。

1.3.3 抗菌膜的制備

稱取10 g玉米淀粉于100 mL蒸餾水中，95 ℃恒溫水浴糊化15 min，固定殼聚糖和魔芋葡甘露聚糖總質(zhì)量1.6 g，稱取殼聚糖與魔芋葡甘露聚糖質(zhì)量比為1.0∶0.6，殼聚糖溶于100 mL 1%乙酸溶液，魔芋葡甘露聚糖溶于100 mL蒸餾水。將上述3 種溶液混合，依次加入7.5 mg/L丙三醇、2.5 mg/L吐溫-80（以300 mL蒸餾水計），再將不同質(zhì)量濃度0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L（以300 mL蒸餾水計）精油加入混合成膜液中，10 000 r/min均質(zhì)4 min，真空脫氣25 min。將排氣泡后的成膜液120 g于預(yù)先清洗干凈的玻璃板流延成膜，于40 ℃、24 h干燥箱烘干揭膜，置于相對濕度55%、25 ℃環(huán)境平衡48 h后測定性能。未添加吐溫-80的薄膜制備步驟同上。

1.3.4 抗菌膜性能測定

1.3.4.1 膜厚度的測定

根據(jù)GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的測定 第3部分：薄塑和薄片的試驗條件》的測試方法[10]，將膜裁成150 mm×15 mm薄條，用螺旋測微器測量復(fù)合膜對角線端及中央各隨機一點厚度（每張膜隨機選取5 個點）。

1.3.4.2 機械性能測定

在1.3.4.1節(jié)測定膜的基礎(chǔ)上，在TA-XT2i物性測試儀上測定薄膜的抗拉強度（tensile strength，TS）和斷裂伸長率（elongation at break，EAB），設(shè)置測速為50 mm/min，初始距離為100 mm。每個樣品重復(fù)測量3 次取平均值[10]。

1.3.4.3 水蒸氣透過系數(shù)（water vapour permeability，WVP）測定

依據(jù)GB 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗方法 杯式法》[11]，使用PERME W3/031水蒸氣透過率測試儀測定復(fù)合膜的WVP，測試溫度38 ℃，相對濕度90%，每個樣品重復(fù)測量4 次，每組實驗重復(fù)3 次。單位為10－12g/（cm·s·Pa）。

1.3.4.4 光學(xué)性能測定

將薄膜裁成12 mm×40 mm矩形，緊貼于比色皿一側(cè)，在600 nm波長處測定其吸光度，按公式（1）計算不透明度，以空比色皿作為對照，測5 個平行樣，單位為mm－1[12]。

式中：A600nm為樣品膜在波長600 nm處的吸光度；x為樣品膜厚度/mm。

使用便攜式色差計依照CIE LAB模式表示抗菌膜顏色。用標(biāo)準(zhǔn)白板GSB A67002-86（L=96.69，a=－0.64，b=0.28）校正，將膜樣品平放在白色校正板上，測定L、a、b和總色差ΔE值。顏色指數(shù)是L=0（黑色）到L=100（白色），－b（藍色）到+b（黃色），－a（綠色）到+a（紅色）。每個樣品選擇3 個點進行測量，取平均值，按公式（2）計算[5]：

式中：L*、a*和b*為玉米淀粉基膜樣品的顏色指數(shù)；L、a和b為標(biāo)準(zhǔn)白板顏色參數(shù)。

1.3.4.5 抑菌性能測定

用打孔器將不同濃度抗菌薄膜裁剪成12 mm直徑圓片，未添加精油薄膜為對照樣片，紫外滅菌20 min。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面接種100 μL實驗菌懸液（106CFU/mL），用無菌涂布棒均勻涂抹3 次。每個平板貼放1 片實驗樣片，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后用測定抑菌圈直徑（包含膜片直徑），取平均值，每組實驗重復(fù)4 次[13]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 20.0、Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，ANOVA法進行方差分析，Duncan多重比較法檢驗進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種植物精油抗菌活性比較及最佳抑菌精油篩選

表1 4 種植物精油對實驗菌的MIC和MBCTable1 MIC and MBC of four typical essential oils against bacteria

如表1所示，牛至精油和迷迭香精油對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，對革蘭氏陰性的大腸桿菌和沙門菌的抑制作用較弱。肉桂精油對3 種實驗菌的MIC雖然在本實驗設(shè)計梯度中相同，但對不同實驗菌的真實抑菌濃度可能在3.125 mg/mL與更低梯度之間。在4 種精油中肉桂精油對3 種實驗菌的MIC和MBC均最低。綜上所訴，4 種精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌都具抑菌效果?？咕钚詮膹姷饺跻来螢椋喝夤鹁停九Ｖ辆停景倮锵憔停久缘憔汀９蔬x用肉桂精油作為玉米淀粉基膜的抑菌劑。

2.2 肉桂精油質(zhì)量濃度對玉米淀粉基膜機械性能的影響

圖1 肉桂精油質(zhì)量濃度對玉米淀粉基膜TS（A）和EAB（B）的影響Fig.1 Effects of different concentrations of cinnamon essential oil on TS (A) and EAB (B) of corn starch-based fi lms

如圖1所示，隨著精油質(zhì)量濃度的增加，薄膜的TS從對照組（20.40±0.64）MPa逐漸降低至（11.71±0.83）MPa，當(dāng)精油質(zhì)量濃度由0.0 g/L增加至10.0 g/L，TS顯著降低（P＜0.05），10.0 g/L和15.0 g/L以及20.0 g/L和2 5.0 g/L兩組精油對應(yīng)的薄膜抗T S無明顯差異（P＞0.05）。而EAB呈先增加后降低的趨勢，精油質(zhì)量濃度為20.0 g/L時達到最大值（36.47±0.53）%。精油對薄膜機械性能的影響取決于精油種類、增塑劑和表面活性劑的使用等[14]。表面活性劑吐溫-80與肉桂精油在成膜液中可形成膠束，吐溫-80分別與肉桂精油和淀粉相互作用，因此淀粉鏈間的氫鍵/相互作用可以被淀粉和吐溫-肉桂精油膠束間的氫鍵/相互作用代替，這改變了聚合物基質(zhì)的完整性并降低了復(fù)合膜的TS[15-16]。而這種代替也造成淀粉鏈分子流動性增加[17]，導(dǎo)致復(fù)合膜柔韌性提高EAB增加。

2.3 肉桂精油質(zhì)量濃度對玉米淀粉基膜WVP的影響

表2 肉桂精油質(zhì)量濃度對玉米淀粉基膜WVP的影響Table2 Effect of different concentrations of cinnamon essential oil on WVP of corn starch-based fi lms

如表2所示，將肉桂精油加入玉米淀粉基膜中導(dǎo)致WVP從（1.94±0.02）×10－12g/（cm·s·Pa）降低至（1.60±0.03）×10－12g/（cm·s·Pa）。但質(zhì)量濃度為5.0 g/L時薄膜WVP無顯著差異（P＞0.05），這可能由于精油和玉米淀粉基膜內(nèi)部交聯(lián)過程產(chǎn)生的微孔結(jié)構(gòu)所致[18]。水蒸氣的轉(zhuǎn)移一般發(fā)生在薄膜親水區(qū)，取決于膜組分的親水-疏水比形成的曲折路徑，因此通常認為向親水性聚合物膜中添加疏水性脂質(zhì)可以改善阻水性能[19]。前人關(guān)于添加百里香、丁香和肉桂精油的殼聚糖膜、添加牛至精油的海藻酸鈉膜、添加百里香精油的玉米淀粉膜等WVP研究已顯示出類似的趨勢[5,18,20]。但也有其他關(guān)于添加精油制膜相反的研究結(jié)果，Hosseini等[21]在魚明膠-殼聚糖膜中添加牛至精油發(fā)現(xiàn)WVP從0.41 g·mm/（h·m2·kPa）增加至0.76 g·mm/（h·m2·kPa），由于脂滴引起聚合物網(wǎng)絡(luò)不連續(xù)，造成膜內(nèi)聚力降低從而增加水蒸氣透過[22]。另有研究表明，盡管脂質(zhì)對薄膜微觀結(jié)構(gòu)的改變是影響阻水性能好壞的決定因素，但是不能由向成膜體系中添加疏水性成分的方式就簡單得出薄膜WVP降低的結(jié)論[18,23]。而本研究結(jié)果顯示當(dāng)肉桂精油質(zhì)量濃度為10.0～25.0 g/L時，與對照組相比玉米淀粉基膜的WVP顯著降低（P＜0.05）。

2.4 肉桂精油質(zhì)量濃度對玉米淀粉基膜光學(xué)性能的影響

表3 肉桂精油質(zhì)量濃度對玉米淀粉基膜光學(xué)性能的影響Table3 Effect of different concentrations of cinnamon essential oil on optical properties of corn starch-based fi lms

如表3所示，當(dāng)肉桂精油質(zhì)量濃度從5.0 g/L增加到15.0 g/L時，L*值沒有明顯差異（P＜0.05），而a*、b*和ΔE值在相同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)顯著變化（P＜0.05）。當(dāng)肉桂精油質(zhì)量濃度從15.0 g/L增加至25.0 g/L時，a*值沒有顯著差異（P＞0.05），而ΔE值與b*值呈增加的趨勢，說明肉桂精油-玉米淀粉基膜顏色向黃色變化，這一變化是由精油本身色素導(dǎo)致。隨著肉桂精油質(zhì)量濃度增加玉米淀粉基膜不透明度與對照組相比顯著增加（P＜0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度為25.0 g/L時肉桂精油-玉米淀粉基膜不透明度為7.29 mm－1，是對照組的1.6 倍。Ghasemlou等[5]將百里香和唇萼薄荷精油添加至玉米淀粉基膜中同樣發(fā)現(xiàn)隨著精油的加入使薄膜不透明度增加。這可能是由于光線在通過脂滴時發(fā)生散射導(dǎo)致漫反射增加[1]，降低了薄膜的透明度。在這種情況下，玉米淀粉基膜外觀呈現(xiàn)黃色，但仍保持透明，如圖2所示，說明其在添加后能很好保持膜的色澤特性。

圖2 含不同質(zhì)量濃度肉桂精油的玉米淀粉基膜照片F(xiàn)ig.2 Photographs of corn starch-based fi lms with different concentrations of cinnamon essential oil

2.5 肉桂精油質(zhì)量濃度對玉米淀粉基膜抑菌性能的影響

表4 不同肉桂精油質(zhì)量濃度的玉米淀粉基膜抑菌圈直徑Table4 Inhibition zone diameters of corn starch-based fi lms with different concentrations of cinnamon essential oil

如表4所示，添加表面活性劑吐溫-80中，未添加精油的對照組對3 種實驗菌均未表現(xiàn)出抑菌性能，而隨著精油質(zhì)量濃度從5.0 g/L增加到25.0 g/L，膜對3 種實驗菌的抑菌性能顯著增強（P＜0.05），均具良好抗菌作用。通常認為精油及其疏水性組分能直接作用于細胞膜，抑制酶與蛋白結(jié)合，增加細胞膜磷脂雙分子層滲透性，導(dǎo)致膜破壞[24]，一般對革蘭氏陽性菌的抑菌作用要強于革蘭氏陰性菌。但在本研究中發(fā)現(xiàn)添加肉桂精油的復(fù)合膜對屬于革蘭氏陰性的大腸桿菌和沙門菌的抑菌圈直徑比對屬于革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大，特別當(dāng)肉桂精油質(zhì)量濃度為20.0 g/L和25.0 g/L時，大腸桿菌的抑菌圈直徑是金黃色葡萄球菌對應(yīng)抑菌圈直徑的2 倍以上。這可能歸因于精油和表面活性劑吐溫-80相互作用，高速均質(zhì)后乳化分子粒徑減小、親水基團暴露，通過外膜轉(zhuǎn)運蛋白將精油有效遞送至革蘭氏陰性菌的細胞膜內(nèi)[25-26]。另一方面，表面活性劑的種類也會影響抑菌效果。Li Wei等[27]研究陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉和非離子型表面活性劑吐溫-80對丁香酚乳液抑菌能力影響，發(fā)現(xiàn)離子型表面活性劑乳劑對金黃色葡萄球菌更敏感，而非離子表面活性劑乳劑對大腸桿菌更敏感。

未加吐溫-80的復(fù)合膜抑菌結(jié)果證實了以上結(jié)論。隨著精油質(zhì)量濃度從10.0 g/L增加至25.0 g/L，膜對3 種實驗菌的抑菌性能仍顯著增強（P＜0.05）。但失去表面活性劑作用后，膜對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌的抑菌作用變得強于革蘭氏陰性的大腸桿菌，這與一般研究精油的抑菌結(jié)果一致[4]。在同等精油質(zhì)量濃度條件下，未添加吐溫-80的復(fù)合膜對沙門菌的抑菌效果有所減弱，可能是因為成膜液中缺少乳化效果導(dǎo)致烘干過程中精油在薄膜的截留量降低，這也解釋了當(dāng)添加質(zhì)量濃度為5.0 g/L時復(fù)合膜未表現(xiàn)出抑菌性能。在2.1節(jié)中，肉桂精油對3 種實驗菌的MIC相同均為3.125 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC低于大腸桿菌。而肉桂精油經(jīng)過與非離子型表面活性劑吐溫-80作用，對金黃色葡萄球菌顯示出比未乳化前更低的抑菌活性，對大腸桿菌卻增強抑菌活性。在前人研究中同樣得到此結(jié)果，如在改性淀粉中添加薄荷精油[28]、乳清蛋白-麥芽糖糊精添加丁香酚[29]顯示出更低的抑菌活性，而在酪蛋白酸鈉中添加百里香精油[30]、海藻酸鈉-吐溫-80添加檸檬精油[31]卻增強抑菌活性。

3 結(jié) 論

根據(jù)植物精油抗菌活性實驗的結(jié)果，肉桂精油對大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為3.125 mg/mL，對沙門菌和金黃葡萄球菌的MBC均為12.5 mg/mL，對大腸桿菌的MBC為25 mg/mL。4 種植物精油的抗菌活性由強到弱依次為：肉桂精油＞牛至精油＞百里香精油＞迷迭香精油，因此選取肉桂精油作為復(fù)合膜的抑菌劑。添加肉桂精油降低了玉米淀粉基膜的TS和WVP，提高了膜的EAB和不透明度。當(dāng)精油質(zhì)量濃度為20.0 g/L時，膜的TS和EAB影響顯著（P＜0.05），此時EAB最大，分別為（12.76±0.84）MPa和（36.47±0.53）%。與對照相比，肉桂精油的加入顯著增加了膜的不透明度（P＜0.05），當(dāng)精油質(zhì)量濃度大于10 g/L時，膜的WVP顯著降低（P＜0.05）。加入肉桂精油改變了膜的顏色，其b*值和ΔE值顯著增加（P＜0.05），L*和a*值降低，膜呈現(xiàn)黃色。添加肉桂精油顯著增強膜對3 種實驗菌的抗菌能力（P＜0.05），發(fā)現(xiàn)精油與吐溫-80相互作用對革蘭氏陰性的大腸桿菌具有協(xié)同作用，當(dāng)質(zhì)量濃度大于20 g/L，抑菌圈直徑超過30 mm最大達到（47.71±2.42）mm；而對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌具有拮抗作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為25.0 g/L時抑菌圈直徑為（19.86±0.20）mm；對沙門菌無明顯增強或減弱效果，當(dāng)質(zhì)量濃度為25.0 g/L時抑菌圈直徑為（23.19±1.98）mm。建議20.0 g/L肉桂精油為最佳質(zhì)量濃度，此時玉米淀粉基膜具有較好的物理性能和抗菌效果。