袁 倩，王 宇，蘇 琳，羅玉龍，蘇日娜，趙麗華，靳 燁*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

蘇尼特羊肉具有蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分含量高、脂肪酸分布合理等諸多優(yōu)點(diǎn)[1]。傳統(tǒng)放牧蘇尼特羊因其肉質(zhì)鮮美備受關(guān)注，近些年由于草場(chǎng)環(huán)境惡化導(dǎo)致其肉質(zhì)下降。因此，尋找能夠改善肉品品質(zhì)的飼養(yǎng)方式和其他改善途徑迫在眉睫。我國(guó)綿羊飼養(yǎng)方式主要有舍飼飼養(yǎng)、放牧加舍飼育肥飼養(yǎng)、放牧飼養(yǎng)3 種方式。如果從羊肉的風(fēng)味和蛋白質(zhì)、還原糖、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分含量來(lái)考慮，放牧飼養(yǎng)一般優(yōu)于舍飼飼養(yǎng)[2]。但是，過(guò)度放牧使草場(chǎng)條件變差，從而使育肥效果變差、出欄時(shí)間加長(zhǎng)、羊肉產(chǎn)量減少，降低了經(jīng)濟(jì)效益[3]。而放牧結(jié)合舍飼飼養(yǎng)則可通過(guò)人工營(yíng)養(yǎng)搭配，調(diào)控肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）含量。營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)IMF含量的影響最為明顯，營(yíng)養(yǎng)水平高能增加肌內(nèi)脂肪沉積水平，適當(dāng)含量的肌內(nèi)脂肪使肉的橫切面呈大理石狀，可以使肉柔軟多汁、口感細(xì)嫩，并且可以改善肉及肉制品的保水性、嫩度、風(fēng)味和質(zhì)地[4]。吉帥等的研究表明，舍飼和半舍飼飼養(yǎng)可以降低羊肉膻味，其在改變羊肉感官品質(zhì)的同時(shí)可以產(chǎn)生較好的嫩度和脂肪香味[5]。還有研究表明在放牧飼養(yǎng)條件下，動(dòng)物可以從牧草中攝入較多的維生素（VA、VC、VE等）和多不飽和脂肪酸，以及具有抗氧化活性的礦物質(zhì)等，從而影響肉品品質(zhì)[6]。Akin等在不同飼養(yǎng)方式對(duì)Damascus羊胴體品質(zhì)和肉品品質(zhì)影響的研究中指出，羊所食牧草和飼料中VE含量不同導(dǎo)致羊肉脂肪抗氧化性能不同，進(jìn)而導(dǎo)致肉品品質(zhì)不同[7]。Priolo等的研究表明舍飼飼養(yǎng)羊肌肉更加柔軟多汁，其保水性更好[8]。

一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可以通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物糖代謝、脂代謝和蛋白質(zhì)代謝等機(jī)體代謝影響肉品品質(zhì)[9-13]。目前為止，關(guān)于AMPK表達(dá)對(duì)肉品品質(zhì)影響的研究大多集中在糖代謝途徑中。馬曉冰研究了飼養(yǎng)方式對(duì)宰后蘇尼特羊肉AMPK、糖酵解及肉品品質(zhì)的影響，結(jié)果表明AMPK活化后能夠提高己糖激酶的活力，加速糖酵解進(jìn)程，導(dǎo)致乳酸含量增加。乳酸含量是影響宰后肌肉pH值的重要因素，進(jìn)而會(huì)影響羊肉品質(zhì)[14]。AMPK通過(guò)對(duì)脂肪代謝的調(diào)控來(lái)影響肉品品質(zhì)，其主要是通過(guò)調(diào)控脂肪代謝相關(guān)基因和酶的表達(dá)影響肌內(nèi)脂肪沉積來(lái)實(shí)現(xiàn)的，目前對(duì)這方面的研究較少。飲食、運(yùn)動(dòng)、溫度等因素都可以激活A(yù)MPK，活化的AMPK抑制乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC），導(dǎo)致丙二酸單酰輔酶A含量減少，減弱了對(duì)肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyltransferase，CPT1）的抑制作用，促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化分解[13,15]，從而使脂肪沉積減少、嫩度降低，進(jìn)而影響肉品品質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)就不同飼養(yǎng)方式對(duì)AMPK-ACC-CPT1信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，進(jìn)而研究AMPK在蛋白水平和基因水平對(duì)脂肪代謝的調(diào)節(jié)、IMF含量及肉品品質(zhì)的影響，旨在為通過(guò)調(diào)控AMPK活力改善肉品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12 月齡健康無(wú)病放牧和舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊各12 只，公母各半，由內(nèi)蒙古烏拉特中旗育種園區(qū)提供。

RNAiso Plus試劑、Premix Taq Version2.0（loading dye mix）預(yù)混液、PrimeScript RT reagent試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒、6×loading buffer、Marker DL2000 大連寶生物工程有限公司；RNase-free水北京天根生物技術(shù)有限責(zé)任公司；焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC） 美國(guó)Intrivogen公司；核酸染料 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；綿羊AMPK酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、綿羊ACC ELISA試劑盒、綿羊CPT1 ELISA試劑盒、綿羊p-AMPK ELISA試劑盒、綿羊p-ACC ELISA試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京eBio-top技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112C超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；5430R低溫臺(tái)式冷凍離心機(jī)、移液槍 德國(guó)Eppendorf公司；BG-power5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、水平電泳槽 北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；普通PCR儀 美國(guó)AB公司；H2500R-2高速冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pH-STAR型胴體直測(cè)式pH計(jì)德國(guó)MATTHAUS公司；制冰機(jī) 寧波格蘭特制冷設(shè)備制造有限公司；快速混勻儀 常州國(guó)華電器有限公司；C-LM3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院；TC-P2A全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì) 北京奧依克光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取12 月齡健康無(wú)病放牧和舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊各12 只，公母各半。放牧飼養(yǎng)組羊白天放牧，晚上不予補(bǔ)飼，牧草種類主要以烏拉特中旗荒漠化草原典型牧草（包括芨芨草、蒙古蔥、中間錦雞兒、沙生冰草、堿韭等10余種）為主。舍飼飼養(yǎng)組羊模擬內(nèi)蒙古限牧政策下的飼養(yǎng)模式，即前9 個(gè)月同放牧飼養(yǎng)組，后3 個(gè)月舍飼育肥。育肥階段食用農(nóng)區(qū)飼草料（玉米秸稈、葵盤粉、葵花籽皮等，同時(shí)補(bǔ)充玉米精料）。兩組實(shí)驗(yàn)羊在共同放牧9 個(gè)月后平均體質(zhì)量大致相同。12 個(gè)月宰后選取股二頭肌，一部分進(jìn)行肉品品質(zhì)測(cè)定，另一部分分割成小塊放入凍存管后投入液氮速凍，在－80 ℃冰箱保存，待測(cè)定酶活力和質(zhì)量濃度以及相關(guān)基因mRNA表達(dá)量時(shí)使用。

1.3.2 AMPK、ACC、CPT1的活力與質(zhì)量濃度的測(cè)定

酶的提?。涸?0 mL的離心管中加入2.7 mL冰凍的PBS，取冰凍的肌肉樣品0.3 g（冰凍肌肉在－80 ℃保存）。在3 000 r/min下冰浴勻漿，每個(gè)樣品勻漿2～3 次，每次1 min，然后將勻漿后的樣品在4 ℃、4 000 r/min下離心15 min，將上清液分裝入1.5 mL離心管待測(cè)定時(shí)使用。

酶活力和質(zhì)量濃度的測(cè)定（以AMPK為例）：采用生物素雙抗體夾心ELISA法測(cè)定樣品中AMPK的質(zhì)量濃度。向預(yù)先包被了AMPK單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入AMPK，溫育后加入生物素標(biāo)記的抗AMPK抗體，再與鏈酶親和素-過(guò)氧化物酶結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，經(jīng)過(guò)溫育和洗滌去除未結(jié)合的酶，然后加入試劑盒中底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化成黃色，其顏色深淺與樣品中AMPK的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。ACC、CPT1、p-AMPK、p-ACC質(zhì)量濃度的測(cè)定方法同上。

測(cè)定流程為：準(zhǔn)備試劑、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品→加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃反應(yīng)90 min→洗板2 次，加入生物素抗體工作液，37 ℃反應(yīng)60 min→洗板3 次，加入親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合工作液，37 ℃反應(yīng)30 min→洗板5 次，加入TMB顯色工作液，37 ℃避光反應(yīng)30 min→加入TMB終止液→30 min之內(nèi)讀取OD值→計(jì)算樣品和標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)因子質(zhì)量濃度。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定

采用TRIzol法提取總RNA，采用瓊脂糖凝膠法和紫外-分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的完整性和質(zhì)量濃度。cDNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備，置于－20 ℃保存待用。目的基因和管家基因的引物參照NCBI中提供的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序?yàn)椋?5 ℃、30 s；95 ℃、5 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃、24 h。按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說(shuō)明書中CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀步驟操作。以AMPKα1、AMPKα2、ACC和CPT1作為實(shí)驗(yàn)基因，18S RNA作為管家基因，分別做3 個(gè)平行。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table1 Primers used for relative quantif i cation by real time PCR

1.3.4 肉品品質(zhì)的測(cè)定

動(dòng)物屠宰前禁食12 h、禁水2 h，屠宰后選擇股二頭肌進(jìn)行肉品品質(zhì)測(cè)定。pH值利用pH-STAR型胴體直測(cè)式pH計(jì)測(cè)定。在宰后45 min時(shí)測(cè)定初始pH值，記作pH0，靜置排酸24 h時(shí)測(cè)定最終pH值，記作pH24[16]。將肉樣修整成3 cm×3 cm×1 cm的形狀，使用TC-P2A全自動(dòng)測(cè)色色差儀測(cè)定肉品顏色[17]，結(jié)果分別用亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）表示。將肉樣修整成2.5 cm×3 cm×5 cm大小的肉塊，密封后置于75 ℃水浴鍋中煮45 min，取出后待肉塊變涼，順著肌纖維方向?qū)⑷鈮K修成大小為3 cm×1 cm×1 cm的條狀，測(cè)定剪切力以表征其嫩度[18]。稱取肉樣30.0～50.0 g置于沸水中煮45 min，取出后置于室溫自然冷卻30～40 min，瀝干水分再次稱質(zhì)量，以煮后質(zhì)量與煮前質(zhì)量比值的百分?jǐn)?shù)表示熟肉率。IMF含量的測(cè)定采用索氏抽提法[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)方式對(duì)AMPK-ACC-CPT1通路相關(guān)酶質(zhì)量濃度和活力的影響

p-AMPK質(zhì)量濃度代表AMPK的磷酸化程度，p-AMPK質(zhì)量濃度/AMPK質(zhì)量濃度表示AMPK的活力，其值越大表示AMPK活力越高；相似地，p-ACC質(zhì)量濃度代表ACC的磷酸化程度，p-ACC質(zhì)量濃度/ACC質(zhì)量濃度代表ACC活力的倒數(shù)，其值越大表示ACC活力越低[20]。

圖1 飼養(yǎng)方式對(duì)AMPK-ACC-CPT1通路相關(guān)酶質(zhì)量濃度（A）和酶活力（B）的影響Fig.1 Effects of feeding systems on enzyme concentrations （A） and activities （B） related to the AMPK-ACC-CPT1 pathway

由圖1可知，放牧飼養(yǎng)組股二頭肌的AMPK質(zhì)量濃度、AMPK活力和CPT1質(zhì)量濃度顯著高于舍飼飼養(yǎng)組，ACC活力顯著小于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），而二者ACC質(zhì)量濃度差異不顯著（P＞0.05）。Kido等的研究表明，運(yùn)動(dòng)使p-AMPKα蛋白表達(dá)與磷酸化水平和p-ACC蛋白表達(dá)水平顯著增加，表示運(yùn)動(dòng)在蛋白水平上可以顯著增加AMPK-ACC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)[21]，這與本研究結(jié)果一致。Yook等[22]對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)和Granlund等[23]對(duì)豬的實(shí)驗(yàn)均證明運(yùn)動(dòng)在蛋白水平上可以激活A(yù)MPK，增加AMPK蛋白表達(dá)量。由于放牧飼養(yǎng)羊的運(yùn)動(dòng)量遠(yuǎn)多于舍飼飼養(yǎng)羊，所以放牧飼養(yǎng)條件下其股二頭肌的AMPK質(zhì)量濃度顯著高于舍飼飼養(yǎng)。除此之外，也有研究表明放牧飼養(yǎng)羊所食牧草中不飽和脂肪酸含量較舍飼飼養(yǎng)組高，不飽和脂肪酸也有激活A(yù)MPK、促進(jìn)AMPK表達(dá)的作用[24-25]。AMPK的激活對(duì)ACC的表達(dá)有抑制作用，ACC被抑制后會(huì)釋放CPT1攜帶長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞膜，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸β氧化，從而減少脂肪沉積[26-27]。

2.2 飼養(yǎng)方式對(duì)AMPK-ACC-CPT1通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

2.2.1 總RNA提取結(jié)果

圖2 總RNA提取結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of total RNA

由圖2可知，28S、18S處條帶清晰明亮，總RNA完整無(wú)降解。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光度均在1.8～2.1之間，可知RNA純度高，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 AMPK-ACC-CPT1通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

表2 飼養(yǎng)方式對(duì)AMPK-ACC-CPT1通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響Table2 Effects of feeding systems on mRNA expression of genes related to the AMPK-ACC-CPT1 pathway

由表2可知，放牧飼養(yǎng)組AMPKα2 mRNA表達(dá)量顯著大于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），而ACC mRNA表達(dá)量顯著小于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），AMPKα1、CPT1 mRNA表達(dá)量在兩種飼養(yǎng)方式間無(wú)顯著差異。張凱杰的研究表明，抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以增加AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達(dá)量[28]。梁俊芳在基因敲除對(duì)小鼠骨骼肌代謝的研究中發(fā)現(xiàn)，AMPKα2敲除后，AMPK活力顯著下降，AMPK-ACC通路受阻[20]。Hu Xiyi等在限制飲食對(duì)雞骨骼肌AMPK通路影響的研究中也發(fā)現(xiàn)，限制飲食可以激活骨骼肌AMPK，進(jìn)而激活A(yù)MPK-ACC通路，且在基因水平上對(duì)調(diào)控此通路起主要作用的是AMPKα2[29]，與本研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，在基因水平上對(duì)AMPK-ACC-CPT1通路起主要調(diào)控作用的是AMPKα2。

2.3 飼養(yǎng)方式對(duì)IMF含量的影響

圖3 不同飼養(yǎng)方式對(duì)IMF含量的影響Fig.3 Effects of feeding systems on IMF content

由圖3可知，放牧飼養(yǎng)蘇尼特羊肉中的IMF含量顯著低于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05）。這可能是由于運(yùn)動(dòng)可以激活A(yù)MPK-ACC-CPT1通路，促進(jìn)脂肪酸氧化，減少脂肪的合成。張潔等在對(duì)AMPK在機(jī)體骨骼肌運(yùn)動(dòng)代謝適應(yīng)方面的研究中得出結(jié)論，運(yùn)動(dòng)可以激活A(yù)MPK[30]。AMPK-ACC-CPT1通路激活后，脂肪沉積減少。Niu Yanmei等在對(duì)改善小鼠骨骼肌胰島素抵抗的研究過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可以激活A(yù)MPKα-ACC-CPT1信號(hào)通路[31]。黃進(jìn)寶在對(duì)茶多酚對(duì)肉雞脂肪代謝的影響的研究中得出結(jié)論，AMPK-ACC-CPT1通路被激活后可以促進(jìn)脂肪酸氧化，減少脂肪合成[32]。George等的研究表明舍飼飼養(yǎng)羊IMF含量顯著高于放牧飼養(yǎng)羊[33]，與本研究結(jié)果一致。

2.4 飼養(yǎng)方式對(duì)肉品品質(zhì)的影響

表3 飼養(yǎng)方式對(duì)肉品品質(zhì)的影響Table3 Effects of feeding systems on meat quality

由表3可知，放牧飼養(yǎng)組羊股二頭肌pH24顯著低于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05）。對(duì)于色澤來(lái)說(shuō)，股二頭肌的L*值和b*值均為放牧飼養(yǎng)組顯著高于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05）。肌肉亮度越低，肉表面反射的光越少，表明肉表面越干燥。Castellini[34]和張惠[35]等對(duì)草場(chǎng)散養(yǎng)肉雞肌肉品質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)由于散養(yǎng)組雞肉的持水力降低，肌肉中大量水分到達(dá)肌肉表面，使得肌肉的亮度顯著增加，這與本研究結(jié)果一致。本研究中放牧飼養(yǎng)組羊股二頭肌黃度顯著大于舍飼飼養(yǎng)組，此類的相關(guān)報(bào)道較少，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。放牧飼養(yǎng)組羊股二頭肌剪切力顯著大于舍飼飼養(yǎng)組，表明放牧飼養(yǎng)組羊肉嫩度顯著小于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），這可能是由于放牧可以在一定程度上激活A(yù)MPK，同時(shí)激活A(yù)MPK-ACC-CPT1通路，促進(jìn)脂肪酸氧化，抑制脂肪沉積，使得放牧飼養(yǎng)組羊肉IMF含量顯著低于舍飼飼養(yǎng)組，由于IMF含量與嫩度呈正相關(guān)[19]，最終使放牧飼養(yǎng)羊肉嫩度顯著低于舍飼飼養(yǎng)。

3 結(jié) 論

不同飼養(yǎng)方式對(duì)AMPK表達(dá)具有影響，放牧飼養(yǎng)較舍飼飼養(yǎng)可以促進(jìn)AMPK表達(dá)，激活A(yù)MPK-ACC-CPT1通路，減少蘇尼特羊肉脂肪沉積，進(jìn)而影響其色澤、嫩度等諸多肉品品質(zhì)指標(biāo)。在當(dāng)前草場(chǎng)載畜力不足的情況下，研究既能改善肉品品質(zhì)又能滿足草場(chǎng)可持續(xù)發(fā)展要求的新型限牧養(yǎng)殖模式具有重大意義。與此同時(shí)，通過(guò)調(diào)控AMPK的活力改變肌內(nèi)脂肪沉積水平，進(jìn)而改善不同飼養(yǎng)方式下的肉品品質(zhì)，為未來(lái)養(yǎng)殖提供了新思路。

放牧飼養(yǎng)組羊股二頭肌AMPK質(zhì)量濃度、AMPK活力和CPT1質(zhì)量濃度顯著高于舍飼飼養(yǎng)組，ACC活力顯著小于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），說(shuō)明放牧飼養(yǎng)可以在蛋白水平上激活A(yù)MPK-ACC-CPT1通路。放牧飼養(yǎng)組羊AMPKα2 mRNA表達(dá)量顯著高于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），ACC mRNA表達(dá)量顯著低于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），說(shuō)明在基因表達(dá)水平上對(duì)AMPK-ACC-CPT1通路起主要調(diào)控作用的是AMPKα2亞基。放牧飼養(yǎng)蘇尼特羊肉中的IMF含量顯著低于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），說(shuō)明運(yùn)動(dòng)可以激活A(yù)MPK-ACC-CPT1通路，促進(jìn)脂肪酸氧化，減少脂肪的合成。放牧飼養(yǎng)組羊股二頭肌剪切力顯著大于舍飼飼養(yǎng)組（P＜0.05），表明放牧飼養(yǎng)組羊肉嫩度小于舍飼飼養(yǎng)組，說(shuō)明放牧飼養(yǎng)可以一定程度上激活A(yù)MPK，同時(shí)激活A(yù)MPK-ACC-CPT1通路，促進(jìn)脂肪酸氧化，抑制脂肪沉積，進(jìn)而使得放牧飼養(yǎng)組羊肉IMF含量顯著低于舍飼飼養(yǎng)組，最終使其嫩度顯著低于舍飼飼養(yǎng)組，影響肉品品質(zhì)。