闞 娟，萬(wàn) 冰，解王晶，陳翠翠，劉 俊，金昌海*

（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

百合是我國(guó)衛(wèi)生部審批通過(guò)的首批藥食兼用資源，其食用價(jià)值和藥用價(jià)值日益受到海內(nèi)外消費(fèi)者的重視，有很高的市場(chǎng)價(jià)值。百合鱗片由許多肉質(zhì)鱗片組成，鱗片肥厚、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有芳香氣味與微苦滋味，能刺激食欲、幫助消化[1]。但是百合在采后貯藏過(guò)程中極易發(fā)生褐變[2-3]。Aguilera等[4]提出細(xì)胞膜是一種半透性膜，維持著細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，當(dāng)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)，細(xì)胞的區(qū)室化被破壞，細(xì)胞內(nèi)容物滲出，使底物滲出，并與酶反應(yīng)導(dǎo)致褐變。Purev等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱、光照、重金屬及高滲透壓等逆境下，植物體內(nèi)過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）的表達(dá)量及活性都有所提高，說(shuō)明CAT在植物抗逆方面發(fā)揮著重要作用。Siedow[6]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的H2O2會(huì)對(duì)果實(shí)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）啟動(dòng)并參與膜系統(tǒng)的脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程，加劇細(xì)胞膜的降解[7]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能夠緩解膜脂過(guò)氧化反應(yīng)中代謝產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的積累以及使細(xì)胞膜通透性增加，促使果蔬形成防御結(jié)構(gòu)，提高果蔬抗性[8-9]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)百合鱗片的研究主要在生物活性和抗氧化等方面[10-12]，對(duì)百合鱗莖貯藏過(guò)程中褐變的研究主要集中在褐變相關(guān)酶類(lèi)，如有研究認(rèn)為百合褐變與多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性密切相關(guān)[13]。對(duì)膜脂過(guò)氧化與百合鱗莖褐變之間關(guān)系的研究還少有報(bào)道，對(duì)于百合鱗莖不同層面鱗片貯藏過(guò)程中褐變與膜脂過(guò)氧化之間的關(guān)系研究也鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以宜興卷丹百合作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)新鮮的百合進(jìn)行剝片處理并分成外層、中層、內(nèi)層3 部分，并避光貯藏于4 ℃環(huán)境中，研究了百合鱗片在貯藏過(guò)程中褐變及膜脂過(guò)氧化相關(guān)指標(biāo)，為進(jìn)一步了解百合鱗片褐變與膜脂過(guò)氧化之間的關(guān)系以及深入研究百合鱗片的褐變機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)以宜興卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb.）為材料，采自宜興市百合種植基地。

二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Lambda 35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Perkinelmer公司；PT-MR-2100高速組織勻漿機(jī) 瑞士Kinematica公司；5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；SHJ-A6磁力攪拌恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；CX41RF顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

采收大小、果色均勻、成熟度基本一致、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害的產(chǎn)品。采后即刻運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，對(duì)新鮮百合鱗片進(jìn)行剝片處理，選擇無(wú)明顯機(jī)械損傷、無(wú)蟲(chóng)害的百合鱗片，將百合鱗片分為外、中、內(nèi)3 部分，外層即從外向內(nèi)數(shù)1～3 層，內(nèi)層即由內(nèi)向外數(shù)1～3 層，其余為中層，避光貯藏于4 ℃冰箱中，并于貯藏的第0、3、6、9、12、15天分別取樣測(cè)定。

1.3.2 表觀變化的記錄和細(xì)胞活力的測(cè)定

貯藏過(guò)程中每隔3 d取大小相近的各層百合鱗片置于白紙上拍照記錄表觀變化情況。

細(xì)胞活力的測(cè)定參照Heese等[14]的方法略作修改。隨機(jī)取外、中、內(nèi)百合樣品，切成1 mm左右厚的薄片浸入臺(tái)盼藍(lán)染液中（V（臺(tái)盼藍(lán)）∶V（乙醇）∶V（水）∶V（乳酸）∶V（甘油）∶V（苯酚）＝0.067∶1∶1∶1∶1∶1），沸水浴加熱2 min使切片快速染色。冷卻后，將切片浸入適量2.5 g/mL三氯乙醛溶液中，振動(dòng)脫色過(guò)夜。將脫色完成的切片浸入體積分?jǐn)?shù)60%甘油溶液中，用顯微鏡觀察并采集圖片。

1.3.3 褐變度、細(xì)胞膜透性和呼吸強(qiáng)度的測(cè)定

褐變度的測(cè)定按照K u m a r等[15]的方法，以10×OD420nm表示。

細(xì)胞膜透性的測(cè)定按照Z(yǔ)hang Zhengke等[16]的方法，用相對(duì)滲透率表示百合鱗片細(xì)胞膜透性，具體計(jì)算見(jiàn)下式。

呼吸強(qiáng)度的測(cè)定按照Grozeff等[17]的方法，以每小時(shí)每千克新鮮組織吸收CO2的質(zhì)量表示。

1.3.4 內(nèi)源POD活力的測(cè)定

內(nèi)源POD活力用二氨基聯(lián)苯胺DAB顯色試劑盒測(cè)定，顯微鏡觀察和采集圖片。

1.3.5 H2O2含量和超氧陰離子自由基（O2－·）產(chǎn)生速率的測(cè)定

H2O2含量的測(cè)定按照Liu Hong等[18]的方法，H2O2的含量以每克新鮮組織含有的H2O2物質(zhì)的量表示；·產(chǎn)生速率的測(cè)定按照Ren Chunguang等[19]的方法，以每分鐘每克新鮮組織催化羥胺生成NaNO2的物質(zhì)的量表示·產(chǎn)生速率。

1.3.6 MDA含量和LOX活力的測(cè)定

MDA含量測(cè)定按照Gao Hui等[20]的方法，單位為μmol/g；LOX活力的測(cè)定按照Wang Jinghua等[21]的方法，LOX活力以每分鐘每毫克蛋白引起234 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.01為1 個(gè)酶活力單位（U）。1.3.7 SOD、CAT活力的測(cè)定

SOD活力的測(cè)定按照Mahdavian等[22]的方法，1 個(gè)SOD活力單位（U）定義為每克新鮮組織每分鐘對(duì)氮藍(lán)四唑光化還原抑制為50%時(shí)消耗的酶量；CAT活力的測(cè)定按照Bailly等[23]的方法，以每分鐘每毫克蛋白引起240 nm波長(zhǎng)處吸光度減少0.1表示1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)取樣重復(fù)3 次，通過(guò)SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中表觀和細(xì)胞活力的變化

圖1 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中細(xì)胞活力的變化Fig.1 Change in cell activity in different parts of lily bulbs during storage

檢測(cè)細(xì)胞活力最常用的染色試劑是臺(tái)盼藍(lán)，未受損的細(xì)胞其膜結(jié)構(gòu)完整、活力強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不沉淀臺(tái)盼藍(lán)；而受損甚至死亡的細(xì)胞，膜結(jié)構(gòu)被破壞，活力降低，則臺(tái)盼藍(lán)堆積在細(xì)胞內(nèi)。由圖1可以看出，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各層百合鱗片的活細(xì)胞數(shù)量均逐漸減少，但相同貯藏時(shí)間的中層鱗片活細(xì)胞數(shù)量比外層和內(nèi)層多，細(xì)胞活力較強(qiáng)，與圖2表觀變化結(jié)果一致。

圖2 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中的表觀變化Fig.2 Change in appearance of different parts of lily bulbs

2.2 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中褐變度、細(xì)胞膜相對(duì)滲透率和呼吸強(qiáng)度的變化

從圖3A可以看出，各層百合鱗片的褐變度都隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，在0～3 d內(nèi)各層百合鱗片的褐變度變化不顯著（P＞0.05），但是3 d之后呈顯著性增加。中層百合鱗片褐變度在貯藏過(guò)程中總體低于外層和內(nèi)層鱗片，與表觀變化結(jié)果一致。

從圖3B可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各層百合鱗片的相對(duì)滲透率都呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，但是中層百合鱗片相對(duì)滲透率始終低于外層和內(nèi)層鱗片。除了第6、9天外層和中層百合鱗片相對(duì)滲透率差異不顯著外（P＞0.05），在其他貯藏時(shí)間各層均呈現(xiàn)顯著性差異。尤其12～15 d時(shí)，相對(duì)滲透率迅速升高，15 d時(shí)內(nèi)層鱗片相對(duì)滲透率達(dá)到23.97%，是中層鱗片（15.78%）的1.52 倍。在貯藏過(guò)程中，中層百合鱗片細(xì)胞膜損傷程度較輕，與細(xì)胞活力和褐變度變化結(jié)果一致。

從圖3C可以看出，不同層的百合鱗片在貯藏過(guò)程中呼吸強(qiáng)度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)，中層鱗片增長(zhǎng)速率較為緩慢，始終低于外層和內(nèi)層。貯藏當(dāng)天各層百合鱗片呼吸強(qiáng)度無(wú)顯著性差異，第3天和第15天外層和內(nèi)層無(wú)顯著性差異，但中層顯著低于外層和內(nèi)層，6～12 d期間各層鱗片呼吸強(qiáng)度呈顯著性增加，可能是采后貯藏期間營(yíng)養(yǎng)成分的消耗所致。呼吸強(qiáng)度的變化與褐變度及細(xì)胞膜透性變化結(jié)果一致。

圖3 不同部位百合鱗片在貯藏過(guò)程中褐變度（A）、相對(duì)滲透率（B）、呼吸強(qiáng)度（C）的變化Fig.3 Changes in browning degree （A）, relative permeability （B） and respiration intensity （C） in different parts of lily bulbs during storage

2.3 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中內(nèi)源POD活力的變化

DAB顯色試劑盒測(cè)定內(nèi)源POD的活力時(shí)，棕褐色沉淀的量反映了內(nèi)源POD的活力，顏色越深表示POD活力越強(qiáng)。由圖4可以看出，在貯藏過(guò)程中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各層百合鱗片細(xì)胞內(nèi)的棕褐色沉淀先增加后減少，表明內(nèi)源POD活力先升高后降低，貯藏過(guò)程中中層百合鱗片的內(nèi)源POD活力低于外層和內(nèi)層，其中內(nèi)層鱗片中內(nèi)源POD活力最高，與內(nèi)層鱗片中褐變度較高密切相關(guān)。

圖1 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中內(nèi)源POD活力的變化Fig.1 Change in endogenous POD activity in different parts of lily bulbs during storage

2.4 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中H2O2含量和O2－·產(chǎn)生速率的變化

圖5 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中H2O2含量（A）和·產(chǎn)生速率（B）的變化Fig.5 Change in H2O2 content （A） and· production rate （B） in different parts of lily bulbs during storage

由圖5A可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各層百合鱗片的H2O2含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是中層鱗片H2O2含量始終低于外層和內(nèi)層鱗片。在貯藏前9 d，H2O2含量增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，可能是百合受到衰老損傷后引起CAT等酶活力的增加所致；貯藏后期12～15 d，各層鱗片H2O2含量均呈顯著性增加，細(xì)胞受到的氧化損傷也逐漸加重，自我修復(fù)能力下降導(dǎo)致H2O2含量增加較快，同時(shí)加速了組織褐變。

2.5 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中MDA含量和LOX活力的變化

圖6 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中MDA含量（A）和LOX活力（B）的變化Fig.6 Change in MDA content （A） and LOX activity （B） in different parts of lily bulbs during storage

植物體在遭受逆境傷害或者衰老時(shí)，會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化現(xiàn)象，最終產(chǎn)物為MDA。由圖6A可以看出，在貯藏過(guò)程中，各層百合鱗片的MDA含量均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是中層鱗片的MDA含量以及增長(zhǎng)速率均低于外層和內(nèi)層。在貯藏前6 d，MDA含量增長(zhǎng)緩慢，中層和內(nèi)層含量差異不顯著，可能是因?yàn)榘俸显谒ダ虾肿冞^(guò)程中產(chǎn)生的適量H2O2誘導(dǎo)機(jī)體作出一系列反應(yīng)機(jī)制抵御了氧化損傷；貯藏后期9～15 d，外層和中層MDA含量呈顯著性升高，而內(nèi)層鱗片在9～12 d急劇增加，表明貯藏中后期內(nèi)層鱗片膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致MDA大量積累，加劇了褐變的發(fā)生。

LOX活力的增強(qiáng)會(huì)加快細(xì)胞損傷以及植物體衰老。由圖6B可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各層百合鱗片的LOX活力均呈先上升后下降趨勢(shì)，在貯藏12 d時(shí)達(dá)到峰值。中層鱗片的LOX活力上升幅度低于外層和內(nèi)層，且峰值最小，而內(nèi)層鱗片峰值最大。在貯藏前期0～6 d各層鱗片LOX活力差異不顯著，但9～15 d內(nèi)層與外層、中層均呈顯著性差異；這與百合內(nèi)層鱗片褐變嚴(yán)重結(jié)果一致。LOX活力的上升可能是百合鱗片對(duì)衰老等傷害反應(yīng)的“應(yīng)答”。

2.6 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中SOD活力和CAT活力的變化

圖7 不同部位的百合鱗片在貯藏過(guò)程中SOD（A）和CAT（B）活力的變化Fig.7 Change in SOD （A） and CAT （B） activity in different parts of lily bulbs during storage

由圖7A可以看出，各層百合鱗片的SOD活力均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，第9天出現(xiàn)峰值，但是中層鱗片的SOD活力始終比外層和內(nèi)層高，而內(nèi)層鱗片貯藏中、后期SOD活力急劇下降，可能是膜脂過(guò)氧化作用使組織細(xì)胞積累大量的活性氧，細(xì)胞受到不可逆?zhèn)?，自我修?fù)力下降所致。

CAT能將植物體內(nèi)的H2O2催化分解，降低植物受到的過(guò)氧化損傷。由圖7B可以看出，各層百合鱗片的CAT活力均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，第9天時(shí)CAT活力出現(xiàn)峰值，但是中層鱗片的CAT活力始終高于外層和內(nèi)層，具有較強(qiáng)清除H2O2的能力。但在貯藏后期CAT活力逐漸下降，組織受到的氧化損傷不可逆，組織修復(fù)能力下降，百合鱗片褐變加劇。

3 討 論

百合在貯藏過(guò)程中發(fā)生的一系列生理變化，最直觀的表現(xiàn)是顏色的變化。褐變主要是因?yàn)榧?xì)胞受到損傷使多酚滲出后被氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，而醌類(lèi)物質(zhì)可進(jìn)而聚合成“類(lèi)黑精”，外觀上表現(xiàn)為百合表面顏色的加深。本研究結(jié)果表明，百合鱗片采后貯藏過(guò)程中褐變程度的增加伴隨著細(xì)胞活力的降低和細(xì)胞膜的損傷。

POD在過(guò)氧化物存在的條件下能催化多種酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，導(dǎo)致采后果蔬的酶促褐變。植物細(xì)胞中內(nèi)源POD活力常用DAB組織染色法來(lái)測(cè)定，在細(xì)胞內(nèi)POD等氧化酶的作用下，催化H2O2釋放氧，從而與顯色底物DAB發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生棕褐色沉淀，以棕色物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)分布的多少來(lái)反映內(nèi)源POD的活力。本研究中，不同部位百合鱗片細(xì)胞內(nèi)POD活力先上升后下降。這與李文香等[24]對(duì)梨果實(shí)貯藏過(guò)程中POD活力的研究結(jié)果一致。

植物組織衰老過(guò)程中會(huì)因?yàn)橹参锎x產(chǎn)生大量的活性氧攻擊生物膜，造成膜脂過(guò)氧化最終產(chǎn)生MDA[25]。細(xì)胞膜的相對(duì)滲透率可以用來(lái)衡量細(xì)胞膜被破壞的程度，進(jìn)而反映膜脂過(guò)氧化的程度[26]。本研究結(jié)果表明，在貯藏過(guò)程中百合鱗片的MDA含量呈上升趨勢(shì)，而中層百合鱗片的MDA含量均低于外層和內(nèi)層，細(xì)胞膜的相對(duì)滲透率、呼吸強(qiáng)度和MDA含量變化趨勢(shì)相同，這表明細(xì)胞膜透性、呼吸強(qiáng)度和膜脂過(guò)氧化程度呈正相關(guān)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，鱗片組織呈衰老狀態(tài)；這與Lin Yifen等[26]在龍眼果實(shí)中的研究結(jié)果相似。

植物的膜脂過(guò)氧化需要LOX啟動(dòng)和參與。本研究中，褐變相對(duì)較慢的中層百合鱗片LOX活力較低，上升速率較平緩；褐變最快的內(nèi)層鱗片在貯藏過(guò)程中LOX活力峰值最高且上升速率較快。在對(duì)鮮切荸薺[27]和梨[28]的研究中表明，LOX通過(guò)對(duì)膜的氧化損傷促進(jìn)了褐變的發(fā)生。這與本研究的結(jié)果一致，LOX活力與百合鱗片的褐變也密切相關(guān)。

SOD和CAT是植物自由基清除系統(tǒng)中的重要保護(hù)酶，二者協(xié)同作用可以有效阻止活性氧的積累，防止膜脂過(guò)氧化，減輕衰老傷害[29-31]。本研究表明，SOD和CAT活力在貯藏初期和中期不斷增強(qiáng)，均在第9天達(dá)到高峰，可最大程度清除活性氧，減輕氧化傷害；貯藏后期，隨著細(xì)胞受到的氧化傷害不可逆，酶活力降低，膜脂過(guò)氧化程度加劇，因而還會(huì)繼續(xù)產(chǎn)生活性氧[32-33]；其中H2O2和O2－·是最主要的兩種氧自由基，植物在衰老或遭受逆境時(shí)，機(jī)體內(nèi)的H2O2含量和O2－·產(chǎn)生速率會(huì)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。本研究中，百合鱗片中的H2O2含量和O2－·產(chǎn)生速率也隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷上升，這與草莓[33]和菠菜[34]貯藏過(guò)程中活性氧含量的變化研究結(jié)果一致。

綜上，在百合鱗片的貯藏過(guò)程中，百合鱗片細(xì)胞因衰老而造成活性氧積累，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，引起褐變加劇、品質(zhì)下降；但是植物對(duì)逆境（如衰老）的防御機(jī)制非常復(fù)雜，不同防御反應(yīng)之間可能會(huì)存在相互影響、信號(hào)交叉等現(xiàn)象，而根據(jù)之前有關(guān)百合鱗片貯藏期間酚類(lèi)物質(zhì)研究結(jié)果推測(cè)，不同部位百合鱗片在貯藏過(guò)程中褐變程度的差異可能與不同部位酚類(lèi)物質(zhì)的含量組成及對(duì)膜損傷的防御能力差異相關(guān)，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。百合鱗片貯藏過(guò)程中極易發(fā)生褐變，本研究結(jié)果證明其褐變與膜脂過(guò)氧化造成的膜氧化損傷密切相關(guān)。