劉 卓， 賈振軍

(中國(guó)人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 100038)

0 引言

MicroRNA (miRNA)是一類內(nèi)源性表達(dá)、平均片段長(zhǎng)度約為22nt的非編碼小分子RNA。miRNA廣泛存在于各種真核組織和體液中，它們靶向結(jié)合互補(bǔ)的mRNA序列，促進(jìn)了mRNA的降解或者抑制了mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)了基因表達(dá)[1,2]。

miRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)了一系列生物學(xué)過(guò)程，包括有機(jī)體的發(fā)育、組織器官的分化、疾病的發(fā)生等[3-13]，其表達(dá)模式蘊(yùn)含了豐富的生物學(xué)信息。此外，miRNA在各種類型的樣本中都能較為完好的保存，血漿、尿液甚至福爾馬林固定過(guò)的組織中都可以提取到miRNA，且目前檢測(cè)其表達(dá)水平的技術(shù)手段具有很高的靈敏度[14]。這些特點(diǎn)都表明miRNA可成為良好的生物標(biāo)記分子。

在法庭科學(xué)領(lǐng)域，大量研究已發(fā)現(xiàn)不同體液或者組織中的miRNA表達(dá)譜具有差異性[15-24]，可據(jù)此進(jìn)行體液或組織來(lái)源的鑒定，還有研究表明可通過(guò)miRNA表達(dá)的特異性變化推測(cè)死亡方式[25]。近年來(lái)，隨著miRNA檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，在此領(lǐng)域又有了很多新的研究成果。

1 MicroRNA檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)的miRNA檢測(cè)技術(shù)包括微陣列方法(microRNA microarray)和定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)。前者基于核酸雜交技術(shù)，先對(duì)樣本中提取的miRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，再將這些miRNA與DNA探針進(jìn)行雜交，篩選出樣本中的miRNA；后者是先將樣本中提取的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后再對(duì)cDNA進(jìn)行PCR并實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR產(chǎn)物量的累積，通過(guò)生成的PCR產(chǎn)物的水平來(lái)反映原樣本中miRNA的表達(dá)水平。通常將兩種方法結(jié)合起來(lái)，即先通過(guò)微陣列篩選出不同樣本中表達(dá)水平差異性較大的若干個(gè)miRNA分子，再通過(guò)定量反轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)篩選出的miRNA分子進(jìn)行確認(rèn)。近些年來(lái)，高通量測(cè)序方法應(yīng)用到miRNA的檢測(cè)中，即先通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得樣品miRNA的cDNA庫(kù), 接著對(duì)cDNA庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序的過(guò)程中讀取不同序列的miRNA分子的相對(duì)含量，以此獲得樣本中miRNA的表達(dá)譜。3種方法中，只有高通量測(cè)序方法可用于新miRNA分子的發(fā)現(xiàn)，并且可以很好的區(qū)分序列相似的miRNA分子。

2 MicroRNA在法庭科學(xué)鑒定中的最新研究

2.1 鑒定體液或組織來(lái)源

大量的研究表明不同體液來(lái)源的miRNA分子表達(dá)譜具有顯著性差異[19, 21, 23, 24, 26-29]。表1展示了一些研究中發(fā)現(xiàn)的常見體液(血液、精液、唾液、陰道分泌液)中特異性表達(dá)的miRNA分子，但比較后會(huì)發(fā)現(xiàn)不同的研究小組所得出的結(jié)果不完全相同，即標(biāo)記同一種體液的miRNA分子有區(qū)別，造成這種差異的原因可能是檢測(cè)的技術(shù)方法以及使用的引物等的不同。為了使鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，研究者們還引入了一些算法模型來(lái)計(jì)算miRNA分子的表達(dá)水平，通過(guò)計(jì)算結(jié)果來(lái)進(jìn)行體液來(lái)源鑒定[20, 26]。

通過(guò)miRNA鑒定體液來(lái)源還可與DNA分型同時(shí)進(jìn)行。van der Meer等人使用毛細(xì)管電泳的方法進(jìn)行miRNA分型。他們從血液和唾液中提取DNA和miRNA，接著通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA，得到了包含DNA和cDNA的混合提取物。使用毛細(xì)管電泳的方法對(duì)提取物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的STR分型，除了得到DNA分型圖譜外，血液樣本的STR分型圖譜都包含一個(gè)表征血液的miRNA峰，而唾液的STR分型圖則包含了表征唾液的miRNA峰[30]。

與傳統(tǒng)的微陣列方法相比，高通量測(cè)序方法具有更準(zhǔn)確(不易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果)、更全面(能夠發(fā)現(xiàn)新的miRNA分子)的優(yōu)勢(shì)?；谶@種方法，Wang 等人的研究找到了6種用于鑒定靜脈血的miRNA分子和19種用于鑒定唾液的miRNA分子[31]，其中一部分和前人的研究結(jié)果一致，另一部分則完全不同(表1)，這可能是由于高通量測(cè)序方法找到了之前研究中使用傳統(tǒng)檢測(cè)方法沒有發(fā)現(xiàn)的miRNA分子，但這些研究結(jié)果還有待進(jìn)一步證實(shí)。

表1 miRNA在體液中的差異性表達(dá)

除了鑒定體液來(lái)源外，miRNA分型還可用于通過(guò)痕量樣本確定器官或組織來(lái)源。Sauer等人的研究發(fā)現(xiàn)， miRNA分析能夠很可靠的區(qū)分器官組織(腦、腎、肺、肝、心肌、骨骼肌、皮膚)，同時(shí)不影響DNA分型的操作。因此可以作為DNA分型的補(bǔ)充，分析一些實(shí)際的混合樣本、降解樣本以及槍擊或者穿刺后產(chǎn)生的痕量樣本[32]。

2.2 為還原案情提供線索

除了作為潛在的分子標(biāo)記進(jìn)行體液或組織來(lái)源鑒定外，miRNA還能為案件還原提供一些重要信息。Johnson等人使用大鼠作為動(dòng)物模型，使用棉簽收集大鼠頭部槍傷后形成的血跡斑可檢測(cè)到腦組織的分子標(biāo)記miR-124-3p，這意味著可以通過(guò)miR-124-3p來(lái)鑒定遺留在現(xiàn)場(chǎng)的血痕是來(lái)源于頭部槍傷還是胸部槍傷，這就為還原案情提供了重要信息[33]。在后續(xù)研究中，他們用刀片在大鼠的肝部造成貫穿傷，檢測(cè)傷口流出的血液中是否有肝組織的標(biāo)記分子 rno-mir-122-3p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用的刀片上提取微量樣本，其中有67%能夠檢測(cè)出rno-mir-122-3p，而在滴出的血液中也有57%能夠檢測(cè)到rno-mir-122-3p[34]。這些結(jié)果都表明可以通過(guò)miRNA來(lái)鑒定血痕來(lái)源的組織，為還原案件的發(fā)生過(guò)程提供信息。

2.3 通過(guò)microRNA推測(cè)死亡方式

疾病發(fā)生和外界刺激都會(huì)引起miRNA的表達(dá)發(fā)生變化，這使miRNA可能成為鑒定死亡原因的分子標(biāo)記。Yu等人使用小鼠溺亡模型，發(fā)現(xiàn)有8種特異性的miRNA分子在淡水中溺亡的小鼠腦部表達(dá)增加，而在海水中溺亡的小鼠腦部表達(dá)下降[25]。其中，miR-706(靶向HCN1)在淡水中溺亡的小鼠腦中的表達(dá)顯著高于海水中溺亡小鼠。Menathung等人檢測(cè)了急性心肌梗塞死亡后的人血樣，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，miR-499的表達(dá)水平顯著增加[35]。這些結(jié)果都表明可通過(guò)miRNA分子的表達(dá)變化來(lái)推測(cè)可能的死亡原因，為法庭科學(xué)取證提供了新的思路。

2.4 通過(guò)microRNA鑒定涉毒和吸毒史

成癮藥物例如嗎啡、可卡因和安非他明等的使用會(huì)引起miRNA分子的表達(dá)譜發(fā)生變化[36-40]。這些相關(guān)的研究結(jié)果除了揭示成癮相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制外，還提示miRNA分子能夠作為診斷藥物成癮或者鑒定涉毒的生物標(biāo)記物。如在海洛因依賴的患者群體中，其外周血單核細(xì)胞中的一些miRNA分子如miR-582-5p、miR-590-5等的水平與健康人相比是下降的[37, 41]；海洛因?yàn)E用者血漿中的miRNA分子表達(dá)譜也發(fā)生了特異性的變化，有11種miRNA分子表達(dá)水平上升，有9種miRNA分子表達(dá)水平下降[36]。除了海洛因之外，甲基苯丙胺濫用病人血漿中的miRNA表達(dá)譜也得到了研究。與健康人群相比較，甲基苯丙胺濫用病人血漿中miR181a、miR15b、miR-let-7e和miR-let-7d的表達(dá)明顯下降，更有趣的是，這種變化程度與過(guò)去數(shù)月中的藥物使用頻率呈負(fù)相關(guān)[42]。

上述研究結(jié)果都提示特定的miRNA分子及特異性的miRNA表達(dá)譜都有望成為鑒定涉毒和毒品濫用史的新型生物標(biāo)記物。如果能夠進(jìn)一步對(duì)各類濫用毒品人群的血漿miRNA或血細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行充分研究，并找到其與藥物使用頻率之間的關(guān)聯(lián)性，那么miRNA分子將可能成為鑒定毒品濫用、推斷個(gè)體身份和識(shí)別個(gè)人背景的有力證據(jù)。

3 問(wèn)題和展望

miRNA作為一種生物標(biāo)記分子，在鑒定體液來(lái)源、還原案情、推斷死亡方式以及鑒定涉毒等方面擁有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但目前仍然存在一些明顯的問(wèn)題，其中最大的挑戰(zhàn)莫過(guò)于使用的檢測(cè)手段等的不同可能會(huì)造成檢驗(yàn)結(jié)果不一致的情況。因此，要使miRNA分子作為新型生物標(biāo)記物應(yīng)用在法庭科學(xué)領(lǐng)域，還需要大量的研究工作作為理論基礎(chǔ)，同時(shí)需要規(guī)范化的技術(shù)流程和技術(shù)平臺(tái)，做到如同DNA分型一樣，能夠在任何實(shí)驗(yàn)室得到一致并且可靠的鑒定結(jié)果。雖然目前miRNA作為生物標(biāo)記分子的應(yīng)用還不成熟，但其作為小分子具有明顯的操作優(yōu)勢(shì)，并且蘊(yùn)含了很多DNA分子所不能提供的豐富信息，相信以后隨著技術(shù)的進(jìn)步和進(jìn)一步研究的投入，它們?cè)谖磥?lái)的法庭科學(xué)鑒定中將會(huì)發(fā)揮巨大的應(yīng)用價(jià)值。