陳曉佳, 張偉妮, 胡可慧, 孫林浩, 黃小紅

(福建農(nóng)林大學(xué)中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

隨著全球海洋漁業(yè)捕撈資源的不斷衰退，人們對養(yǎng)殖水產(chǎn)品的需求量日益增大[1]，羅非魚因其蛋白含量高、肉質(zhì)肥美、生存能力強(qiáng)而深受全世界人民的喜愛.1976年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)將羅非魚作為優(yōu)秀品種向全球推廣.自2000年起，我國羅非魚總產(chǎn)量以每年14.75%左右的速度遞增[2]，占世界總養(yǎng)殖量的50%[3]，位居全球羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量第一.由于羅非魚對環(huán)境的適應(yīng)能力良好[1]，且在水環(huán)境中對不少有機(jī)污染物有富集作用，成為生態(tài)毒理研究的重要模式魚[4].

全氟化合物具有生物富集性，是一類持久、有污染性的有機(jī)物.全氟化合物由于其良好的熱穩(wěn)定性、抗氧化能力、疏水疏油、不易被代謝等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于紡織、化妝品、殺蟲劑、合成洗滌劑等許多工業(yè)和生活領(lǐng)域.其中，在工業(yè)產(chǎn)業(yè)中有較多應(yīng)用的是全氟辛酸和全氟辛烷磺酸[5-6].全氟化合物有優(yōu)良的水溶特性，能通過大氣進(jìn)行長距離傳輸[7]，導(dǎo)致了其廣泛存在于海水、土壤、大氣等環(huán)境介質(zhì)中，甚至在生物體內(nèi)也能檢測到全氟化合物[8].全氟化合物進(jìn)入生物體的方式繁多，且可以利用生物富集作用在生物體內(nèi)不斷蓄積，對環(huán)境、生物體甚至人類造成危害[9].據(jù)報(bào)道，全氟化合物具有很強(qiáng)的發(fā)育毒性、肝臟毒性、生殖毒性[10].研究發(fā)現(xiàn)，雖然全氟辛烷磺酸在水環(huán)境中的含量較少，但在魚體中卻能檢測到相當(dāng)高的含量，如比目魚肝臟中的全氟辛烷磺酸含量為7 760 μg·kg-1,而野生銀鯽體內(nèi)的全氟辛烷磺酸含量更高達(dá)9 031 μg·kg-1[11].雖然全氟辛酸和全氟辛烷磺酸等長鏈全氟化合物危害大已逐漸減少使用，但有許多與其結(jié)構(gòu)類似、功能相同的短鏈全氟化合物作為替代品投入使用，如全氟己酸、全氟丁烷磺酸鹽等[10].

隨著短鏈全氟化合物的不斷投入使用，這類物質(zhì)在環(huán)境中的含量也會隨之不斷地增加，而目前關(guān)于新型的短鏈全氟化合物在環(huán)境中對魚類影響的研究較為少見.本試驗(yàn)以分離純化于羅非魚肝臟中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetyl-D-glucosaminidase, NAGase)為材料，研究全氟己酸對NAGase的抑制作用，探討環(huán)境中有機(jī)污染物對羅非魚的危害，旨在為羅非魚的安全養(yǎng)殖提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)使用的NAGase為分析純，分離純化于尼羅羅非魚肝臟，比活力為2 988 U·mg-1；底物對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)為上海醫(yī)藥工業(yè)研究院產(chǎn)品；全氟己酸購于阿拉丁公司；其他無機(jī)試劑(AR級國產(chǎn)分析純)均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；本試驗(yàn)所用水均為雙蒸水.

1.2 方法

酶活力采用Chen et al[12]的方法測定；酶蛋白含量采用Lowry[13]的方法測定；采用Tsou[14]的方法測定全氟己酸對羅非魚肝臟NAGase的抑制作用.2 mL含0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 5.7)的測酶活力體系，于37 ℃水浴5 min，加入10 μL酶液，實(shí)時(shí)監(jiān)測不同底物濃度(0.20、0.25、0.30、0.40 mmol·L-1)與不同含量(0.15、0.30、0.45、0.60 mg·mL-1)全氟己酸反應(yīng)體系的反應(yīng)過程.分析底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，求得反應(yīng)速度常數(shù).

上式中：E、S、I、P分別表示羅非魚肝臟NAGase、底物pNP-NAG、全氟己酸(抑制劑)、產(chǎn)物；ES、EI分別表示酶與底物的復(fù)合物、酶與抑制劑的復(fù)合物；Km表示米氏常數(shù)；kp表示反應(yīng)微觀速度常數(shù);k+0、k-0分別表示失活反應(yīng)的正向和逆向的微觀速度常數(shù).一般而言，底物濃度([S])>>NAGase初始濃度[E0]、全氟己酸含量([I])>>[E0]，因此，產(chǎn)物生成量可以用以下方程表示：

(1)

(2)

B=k-0

(3)

公式(1～3)中：[P]t表示反應(yīng)時(shí)間為t時(shí)的產(chǎn)物濃度，A、B分別表示酶受全氟己酸抑制過程中正向和逆向的表觀速度常數(shù)；A[I]+B為表觀抑制速度常數(shù)；v表示不存在抑制劑時(shí)的初始反應(yīng)速度.根據(jù)v=(Vm×[S])/(Km+[S])(米氏方程)，當(dāng)t足夠長時(shí)，產(chǎn)物生成曲線趨于直線，產(chǎn)物濃度寫成[P]calc.

(4)

(5)

ln([P]calc-[P]t)=-(A[I]+B)×t+常數(shù)

(6)

公式(4～6)中，[P]t是t時(shí)實(shí)際獲得的產(chǎn)物濃度.-(A[I]+B)為ln([P]calc-[P]t)對t在不同抑制劑含量下作圖得到直線的斜率.-(A[I]+B)對抑制劑含量[I]作圖得到斜率(A)、截距(B).B等于k-0.

通過公式(2)可得：

(7)

1/A對[S]作圖得到的直線斜率為1/(k+0×Km)，截距為1/k+0.因此，k+0可以獲得.

結(jié)合公式(2)和米氏方程：

(8)

通過不含有抑制劑的不同底物濃度下的底物反應(yīng)可以求得Km、Vm.因此，k+0也能夠輕易求出.

2 結(jié)果與分析

2.1 全氟己酸含量對羅非魚肝臟NAGase活力的影響

圖1 全氟己酸含量對NAGase活力的影響Fig.1 Effect of perfluorohexic acid on the activity of NAGase

0～4：全氟己酸含量分別為0、0.15、0.30、0.45、0.60 mg·mL-1.圖2 不同全氟己酸含量下NAGase活力與酶量的關(guān)系Fig.2 Effect of NAGase concentration on its activity with different concentrations of perfluorohexic acid

剩余酶活力與全氟己酸含量的關(guān)系如圖1所示.圖1顯示，全氟己酸可以抑制羅非魚肝臟NAGase的活力，且全氟己酸對酶的抑制為濃度依賴性.隨著全氟己酸含量的增加，酶剩余活力快速降低.當(dāng)全氟己酸含量為0.29 mg·mL-1時(shí)，酶的相對活力降低至50%.圖2顯示不同全氟己酸含量下酶活力與酶含量的關(guān)系.在不同全氟己酸含量下，以酶剩余活力對酶含量作圖，可以得到一組過原點(diǎn)的直線.全氟己酸含量的增加導(dǎo)致了直線斜率的減小，說明全氟己酸對酶的抑制作用是可逆的.全氟己酸的存在并沒有減少有效酶的量，只是抑制和減小了酶活力.

2.2 全氟己酸對羅非魚肝臟NAGase的抑制類型

采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法研究在不同全氟己酸含量下改變底物濃度對NAGase活力的影響，結(jié)果如圖3a所示.圖3a為一組交于Y軸、斜率不同的直線，說明全氟己酸對NAGase的抑制作用類型為競爭性抑制，Km隨著全氟己酸含量的變化而變化，而Vm則不會改變.這也表明了全氟己酸僅僅對自由酶造成抑制作用.由圖3a中每條直線的表觀Km對全氟己酸含量作圖得到一條直線(圖3b)，可以求得全氟己酸與自由酶結(jié)合的抑制平衡常數(shù)(KI)為0.18 mg·mL-1.

2.3 全氟己酸對羅非魚肝臟NAGase的底物反應(yīng)

動(dòng)力學(xué)

在不同含量全氟己酸的測活體系中，監(jiān)測NAGase水解pNP-NAG反應(yīng)產(chǎn)物量.結(jié)果如圖4a所示.在不同含量全氟己酸的作用下，NAGase水解底物的反應(yīng)速度都隨著時(shí)間的增加不斷減慢直到趨于一條直線，且斜率隨著全氟己酸含量的增加而減小.用Tsou[14]的方法分析以上結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酶在全氟己酸中水解底物的反應(yīng)過程是一個(gè)慢可逆過程.根據(jù)公式(6)，將ln([P]calc-[P]t)對t在不同全氟己酸含量下作圖得到一組斜率為-(A[I]+B)的直線，結(jié)果如圖4b所示.

2.4 不同底物濃度的抑制動(dòng)力學(xué)

在0.45 mg·mL-1全氟己酸中，不同底物濃度的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程如圖5a所示.當(dāng)時(shí)間足夠長時(shí)，初始反應(yīng)速度和虛線的斜率隨著底物濃度的增加而增大.同時(shí)，ln([P]calc-[P]t)對t在不同底物濃度下作圖，得到一組斜率為-(A[I]+B)的直線(圖5b).A、B可以通過圖5b計(jì)算獲得.

0～4：全氟己酸含量分別為0、 0.15、0.30、0.45、0.60 mg·mL-1.圖3 NAGase在全氟己酸中的抑制類型Fig.3 Inhibitory type of NAGase in perfluorohexic acid

a:反應(yīng)過程;b:ln([P]calc-[P]t)的半對數(shù)對t作圖，數(shù)據(jù)來自圖4a中的曲線1～4(0～4：全氟己酸含量分別為0、 0.15、0.30、0.45、0.60 mg·mL-1).圖4 NAGase在不同含量的全氟己酸中水解底物的反應(yīng)過程Fig.4 Course of substrate reaction for NAGase with different concentrations of perfluorohexic acid

a：反應(yīng)過程;b：ln([P]calc-[P]t)的半對數(shù)對t作圖，數(shù)據(jù)來自圖5a中的曲線1～4(1～4：底物濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.40 mmol·L-1).圖5 NAGase在0.45 mg·mL-1全氟己酸中的抑制反應(yīng)Fig.5 Inhibition reaction of NAGase in 0.45 mg·mL-1 perfluorohexic acid

2.5 NAGase抑制微觀速度常數(shù)的計(jì)算

圖4b中的直線斜率對全氟己酸含量作圖得到圖6中的曲線1，同時(shí)收集其他底物濃度下的數(shù)據(jù)，得到圖6的其他幾條直線.圖6中每條直線的縱截距相同，而B通過縱截距求得.B等于k-0(表1).1/A對[S]作圖得到一條交叉于Y軸的直線(圖7).根據(jù)公式(7)，直線的截距等于1/k+0，故表1中的k+0可以求得.同時(shí)， 1/(k+0×Km)為直線的斜率.Km、Vm可以通過不含全氟己酸的底物反應(yīng)計(jì)算得到，分別為0.229 mmol、9.314 μmol·min-1，故k+0也可以通過其斜率得到.A/v對1/[S]作圖得到一條過原點(diǎn)的直線(圖8).根據(jù)公式(8)，圖8中的直線斜率等于(Km×k+0)/Vmax.Km、Vm已知，故k+0可以再次從圖8中的斜率得到.不同計(jì)算方法求得的k+0見表1.

1～4：底物濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.40 mmol·L-1.圖6 直線圖(ln([P]calc-[P]t)對t)的負(fù)斜率對[I]作圖Fig.6 Second plots of the slopes versus the concentration of perfluorohexic acid [I]

A來自圖6中直線的斜率.圖7 1/A對[S]作圖Fig.7 Plot of 1/A versus substrate[S]concentration

3 討論

據(jù)報(bào)道，全氟化合物對斑馬魚胚胎、錦鯉、稀有鮈鯽等生物有一定的毒性作用[15].全氟化合物的碳鏈長度不同，其毒性也不同，在一定范圍內(nèi)，隨著碳鏈長度的增加，毒性增大[10].由于長碳鏈全氟化合物危害大而逐漸被禁止使用，因此一些短鏈型的全氟化合物投入生產(chǎn).全氟己酸是新型全氟化合物的替代物，為短碳鏈型，具有生物富集性，不易降解[10]，且可以在各種環(huán)境介質(zhì)中被檢測出來.而目前關(guān)于全氟己酸的研究并不多見，因此，本試驗(yàn)選擇其作為抑制劑.本試驗(yàn)結(jié)果表明，全氟己酸能有效抑制羅非魚肝臟NAGase的活力，其IC50為0.29 mg·mL-1.圖2、圖3顯示，全氟己酸對羅非魚肝臟NAGase的抑制作用為可逆的競爭性抑制，其KI為0.18 mg·mL-1.由于在不同含量的全氟己酸中產(chǎn)物生成速度最后都會趨于直線(圖4a)，因此，全氟己酸與自由酶分子結(jié)合為可逆反應(yīng).底物存在的情況下，使用方案1模型、競爭型抑制劑和自由酶作用的動(dòng)力學(xué)模型.根據(jù)理論推導(dǎo)，A/v對1/[S]的作圖應(yīng)該為一條過原點(diǎn)的直線，本試驗(yàn)根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果繪制的圖8與理論推導(dǎo)結(jié)果一致，可以得出結(jié)論：全氟己酸為羅非魚肝臟NAGase的競爭型抑制劑.全氟己酸與底物競爭自由酶，阻礙底物與酶的結(jié)合從而影響酶活力，導(dǎo)致其活力降低.表1中的k+0、k-0分別來自于圖7中直線的斜率、其在縱坐標(biāo)上的截距以及圖8中直線的斜率，可以看到3個(gè)數(shù)值幾乎相等，說明本試驗(yàn)建立的NAGase在全氟己酸中的反應(yīng)模型是正確的.

表1 NAGase在全氟己酸中的KI和k+0、k-0Table 1 Inhibitory equilibrium constants and microscopic rate constants for NAGase in perfluorohexic acid solution

a來自于圖7中直線的縱軸截距；b來自于圖7中直線的斜率；c來自于圖8中直線的斜率.