廉法卓, 林熠斌, 胡 林, 王 杰, 曾任森,, 宋圓圓,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院作物抗性與化學(xué)生態(tài)學(xué)研究所，福建 福州 350002)

自然界中，同種植物間和不同種植物間是否都存在 “通訊對話”一直是科學(xué)家感興趣的科學(xué)問題.比如植物受到蟲害誘導(dǎo)產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物(volatile organic compounds, VOCs)可誘導(dǎo)鄰近健康受體植物產(chǎn)生抗蟲等防御反應(yīng)，這些揮發(fā)性有機物中的某些成分如茉莉酸甲酯則是植物間進行地上部信息通訊的信號物質(zhì)[1-3].除此之外，研究發(fā)現(xiàn)寄生植物菟絲子在不同寄主間可傳遞有生態(tài)學(xué)效應(yīng)的抗蟲系統(tǒng)性信號，通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組和代謝物響應(yīng)來提高抗蟲性，并進一步證明菟絲子傳導(dǎo)的抗蟲系統(tǒng)性信號產(chǎn)生和傳播速度非?？?約1 cm·min-1)，且可以遠距離傳遞(超過100 cm)[4].可見，植物間的“通訊對話”可以幫助受傷植物和鄰近未受傷植物間建立起抗性防御聯(lián)盟.

菌根(mycorrhiza)是土壤真菌與高等植物營養(yǎng)根系相互作用形成的種間互利共生聯(lián)合體[5-6].在一個植物群落中，植物菌根菌絲能夠在土壤中形成一個密集的地下網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)——菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)(CMNs，又名菌絲橋)，構(gòu)成植物在地下進行物質(zhì)交流的通道，進行無機營養(yǎng)物質(zhì)和有機光合產(chǎn)物等的傳遞[6-7].本實驗室先后發(fā)現(xiàn)CMNs可以介導(dǎo)番茄植物間抗病和抗蟲防御信號的通訊[8-9]，即當(dāng)供體番茄植株受到病原菌侵染或者昆蟲取食后，有CMNs連接的鄰近健康受體番茄植株會“偷聽”到這種防御信號，促使植物提前做好防御準備，進而提高植物的抗病和抗蟲能力.苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)參與植物體內(nèi)多種生理代謝過程，PAL和PPO參與植物酚酸、木質(zhì)素、類黃酮和香豆酸酯類等抗性物質(zhì)的合成，這些酶常被用作衡量植物體內(nèi)抗性防御反應(yīng)的重要指標(biāo)[8-12].李朕等[13]研究表明，機械損傷刺槐后，有菌根侵染的植物以及與受傷植物有菌根菌絲橋連接的受體刺槐幼苗的PAL和POD酶活性更高.此外，機械損傷也可誘導(dǎo)玉米直接防御蛋白調(diào)控基因β-1,3-葡聚糖基因(PR2)等的表達[14].可見闡明菌根真菌與宿主植物間復(fù)雜的協(xié)同進化關(guān)系，認識菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)獨特的生態(tài)學(xué)功能，可為今后農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上利用菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)種群個體間的關(guān)系以及提高農(nóng)作物抗性提供理論基礎(chǔ).

關(guān)于菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)可介導(dǎo)植物間抗病和抗蟲信號的傳遞已有報道[8-9]，而本研究旨在補充闡述供體番茄葉片在機械損傷之后，鄰近健康的受體植株可否通過CMNs感應(yīng)到供體植株受到的損傷信號，并提前啟動抗性防御反應(yīng).因此，本試驗通過對供體番茄進行機械損傷，研究CMNs介導(dǎo)的受體番茄葉片中防御酶和抗氧化酶活性以及葉片和根系中防御相關(guān)基因苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)和PR2基因的表達情況，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上利用CMNs介導(dǎo)的防御信號傳遞來增強作物的抗性具有重要的指導(dǎo)作用.

1 材料與方法

1.1 供試材料

番茄(LycopersiconesculentumMill)種子購于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，品種為金寶.摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)中心劉潤進教授提供，經(jīng)玉米作為宿主擴繁后使用[15]，擴繁后為根系沙子混合物：包括摩西管柄囊霉侵染的根斷、菌絲和孢子(每克根系沙子混合物有35個孢子).斜紋夜蛾(SpodopteralituraFabricius)由福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院作物抗性與化學(xué)生態(tài)學(xué)實驗室提供.供試土壤取自福建農(nóng)林大學(xué)校內(nèi)農(nóng)場砂壤土，土壤過10 mm篩后，121 ℃濕熱滅菌30 min，在干熱180 ℃條件下滅菌2 h，以殺滅土壤中的真菌孢子.

1.2 試驗設(shè)計

圖1 試驗裝置示意圖Fig.1 Sketch of experiment setup

試驗裝置如圖1所示.

處理A：供體番茄幼苗接種Fm(100 g)，供體與受體植株間用30 μm尼龍膜間隔，40 d后兩植株間建立CMNs，此時對供體葉片進行機械損傷處理；

處理B：供體番茄幼苗未接種Fm，供體與受體植株間無CMNs，40 d后對供體葉片進行機械損傷處理；

處理C：供體與受體番茄苗均接種Fm(50 g)，供體與受體植株間用塑料板隔開，供體與受體植株根系均有菌根真菌侵染，但植株間未形成CMNs，40 d后對供體葉片進行機械損傷處理；

處理D：供體番茄苗接種Fm(100 g)，供體與受體植株間用30 μm尼龍膜間隔，兩植株間有CMNs，供體植株不進行機械損傷處理.

為避免機械損傷處理供體番茄產(chǎn)生揮發(fā)物誘導(dǎo)鄰近健康植株產(chǎn)生防御反應(yīng)，供體番茄在進行機械損傷后用帶有可循環(huán)通氣導(dǎo)氣管的塑料袋罩住，保證植物正常氣體交換.其中處理B、C和D分別排除了番茄植物根系分泌物、揮發(fā)物和菌根本身的影響.從而來驗證CMNs可介導(dǎo)番茄植株間機械損傷信號的傳遞(處理A).

1.3 試驗方法

番茄種子經(jīng)8% H2O2消毒10 min，蒸餾水沖洗3次后放在人工氣候箱﹝溫度為(25±1) ℃、濕度70%～75%、光照400 μmol·m-2·s-1﹞內(nèi)催芽生長10 d，選取長勢一致的幼苗種植在經(jīng)0.1% KMnO4溶液消毒的規(guī)格為29 cm×13 cm×11 cm(長×寬×高)的塑料盆內(nèi)(2株·盆-1).塑料盆內(nèi)裝有滅菌的砂壤土2.0 kg，F(xiàn)m菌劑100 g或50 g，最后覆蓋0.5 kg滅菌的砂壤土.對照則是加入等量經(jīng)高壓滅菌(121 ℃，30 min)的Fm菌劑.每個試驗處理設(shè)置5個重復(fù)，隨機擺放在玻璃溫室中，光周期13 h/11 h (N/D)，維持相對濕度在70%～75%，溫度(25±1) ℃，每3 d澆1次Hoagland′s完全營養(yǎng)液.40 d后經(jīng)乳酸酚臺盼藍染色液染色并鏡檢侵染率.隨后對供體番茄機械損傷處理(自頂端向下選取第1、2和3側(cè)枝上的葉片各1片，每側(cè)枝選取第3片完全展開的復(fù)葉，滾輪處理3次·片-1，3片·株-1)，對照是健康生長的番茄植株.

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 菌根侵染率 番茄生長40 d后用直徑1 cm的打孔器隨機取不同處理的番茄根系各100段清洗干凈后分別放于2 mL塑料EP管內(nèi).首先，加1.5 mL 10% KOH溶液在95 ℃條件下加熱10 min；其次，用ddH2O洗凈殘留的KOH溶液后加0.05%乳酸酚臺盼藍染色液在95 ℃條件下加熱染色1 h；最后用ddH2O分色后制片于Olympus BX51顯微鏡下觀察Fm侵染情況[16].菌根侵染率測定采用根段頻率標(biāo)準法[17].

1.4.2 防御酶和抗氧化物酶活性 在機械損傷后的第3、6、12、24、48 h對以上4種處理的番茄葉片取樣0.1 g測定酶活性.其中，苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性測定方法參照中國科學(xué)院上海植物生理研究所主編的《現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南》[18]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[11]；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定方法參照陳利鋒等[12]；多酚氧化酶(PPO)活性測定參照朱廣廉[19]的方法.

1.4.3 總RNA提取和cDNA合成 在機械損傷后的第3、6、12、24、48 h，對以上4種處理的番茄葉片和根系取樣，液氮研磨，用TrizolTMReagent試劑盒(Invitrogen, USA)提供的方法提取番茄植株總RNA，總RNA經(jīng)DNaseI處理后，吸取1 μL用于cDNA的合成.cDNA合成體系為20 μL，所用試劑盒為Goscript系列Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?

1.4.4 熒光定量PCR分析 依據(jù)已報道基因PAL、PR2、番茄組成型表達基因(Ubi3，在此作為內(nèi)參基因)的序列設(shè)計特異引物進行熒光定量PCR，擴增引物見表1.熒光定量PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s，退火溫度(PAL：53.7 ℃；PR2：51.5 ℃；UBI3：51.5 ℃)30 s，72 ℃ 15 s，39個循環(huán)，82 ℃ 1 s.按照康為世紀的UltraSYBR二步法熒光定量PCR試劑盒的程序進行熒光定量PCR反應(yīng).引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

表1 熒光定量PCR所用的特異性引物Table 1 Specific primers for real-time quantification PCR

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SigmaPlot 10.0軟件錄入數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS 19軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，同一時間點不同處理之間的差異顯著性用Tukey′s進行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 供體和受體番茄根系間菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)的建立

乳酸臺盼藍染色結(jié)果表明，處理A和D供體接種Fm后，其供體和受體番茄根系根部都有被侵染，侵染率分別達到62.1%，40.1%和57.1%，35.1%，說明處理A和D成功建立CMNs.處理C供體和受體侵染率分別為45.6%和42.3%，但由于塑料板隔斷，故不存在CMNs而處理B由于沒有接種Fm，因此供體和受體均未檢測到侵染，侵染率為0，說明本處理組未被污染(表2).

表2 接種摩西管柄囊霉40天后供體和受體番茄根系菌根侵染率1)Table 2 Mycorrhizal colonization in ‘donor’ and ‘receiver’ tomato roots inoculated with F.mosseae after 40 days

1)同列不同小寫字母表示同一時間點各處理間差異顯著(P<0.05).

2.2 供體葉片遭受機械損傷對CMNs連接的受體植株葉片防御相關(guān)酶活性的影響

由圖2可知，機械損傷處理預(yù)先接種Fm的供體番茄葉片后，與供體有CMNs連接的鄰近受體番茄葉片防御相關(guān)酶活性均有不同程度的提高(處理A).其中，PAL酶活性在3 h時開始升高，至12 h時達到最高，隨后持續(xù)下降，至48 h時PAL酶活性降至與初始水平相當(dāng).其中在機械損傷處理12 h時，處理A的受體番茄葉片中PAL酶活性比對照處理B、C和D分別高出162.1%、97.8%和164.5%.SOD酶活性在6 h時被誘導(dǎo)升高達到最大值，隨后處理A的SOD活性則一直高于處理B、C和D，在12 h時處理A的受體葉片中 SOD酶活性比處理B、C和D分別高出69.1%、41.0%和56.0%；處理A中的POD酶活性在檢測的5個時間點都顯著高于其他3個處理，并在3 h時POD活性達到最強，隨后呈逐步下降趨勢，其中在12 h時處理A的受體葉片中POD活性比處理B、C和D分別高出230.6%、86.3%和120.9%；而處理A中PPO酶活性在6 h時達到最大值，與處理B、C和D相比，分別提高了54.6%、36.7%和57.0%，至48 h時處理A、B、C和D之間的PPO酶活性無顯著差異.此外，在12 h時，處理A中的PPO酶活性與處理C、D并無顯著差異.可見，供體番茄受到機械損傷后可以通過CMNs的介導(dǎo)將受傷信號傳遞給鄰近番茄植株，提高葉片防御相關(guān)酶活性，使其提前做好防御準備.

*表示同一時間點各處理間差異顯著(P<0.05)；**表示同一時間點各處理間差異極顯著(P<0.01).圖2 機械損傷處理供體番茄植株對有菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)連接的受體植株葉片PAL、SOD、POD和PPO活性的影響Fig.2 Enzyme activities of PAL, SOD, POD and PPO in the leaves of tomato ‘receiver’ plants in response to mechanical damaged CMNs connected ‘donor’ plants

2.3 供體葉片遭受機械損傷對CMNs連接的受體植株葉片和根系防御相關(guān)基因表達的影響

如圖3所示，熒光定量PCR檢測表明，與處理B、C和D相比，機械損傷處理供體番茄葉片后，與供體番茄有CMNs連接的鄰近健康受體番茄葉片中(處理A)PAL基因在3、6、12、24和48 h時均被誘導(dǎo)表達，并在12 h時達到最高，PAL基因表達量分別是供體進行機械損傷但無CMNs連接的處理B的3.9倍，是供體進行機械損傷處理但CMNs連接被阻斷的處理C的3.7倍，以及供體未進行機械損傷處理但有CMNs連接的處理D的6.6倍.同時，與進行機械損傷處理的供體番茄有CMNs連接的鄰近健康受體番茄葉片中PR2在3、6、12、24和48 h時均被誘導(dǎo)表達，各時間段基因表達量分別是處理B的 4.7、2.1、17.3、2.3和3.1倍.無CMNs連接(處理B)、CMNs連接被阻斷(處理C)以及有CMNs連接但供體番茄未進行機械損傷處理(處理D)的受體葉片中PR2基因的表達量在3、6、12和24 h時并無顯著差異.在受體番茄根系中，與進行機械損傷處理的供體番茄有CMNs連接的受體番茄根系中PAL基因在6、12、24和48 h時均被誘導(dǎo)表達，分別是處理B的4.2、7.2、2.6和2.4倍.CMNs連接被阻斷的受體番茄根系中(處理C)PAL基因在12 h時被誘導(dǎo)表達，是無CMNs連接處理B的3.4倍，說明Fm侵染可誘導(dǎo)宿主根系中PAL基因表達.然而，機械損傷處理的供體番茄有CMNs連接的受體植株(處理A)根系中PAL基因的誘導(dǎo)表達效果更顯著，分別是處理B、C和D的7.2、2.1和1.2倍.PR2基因在處理A的受體番茄根系中被誘導(dǎo)表達，且隨著機械損傷處理時間的延長，PR2基因的表達量呈現(xiàn)先升后降再上升的趨勢，并在12 h時達到最高，PR2基因的表達量分別是處理B、C和D的9.0、5.3和12.5倍.由此可見，機械損傷供體番茄葉片后，通過番茄地下CMNs的建立和連接可介導(dǎo)防御信號的傳遞進而誘導(dǎo)受體番茄葉片和根系中PAL和PR2基因的表達，從而間接提高了鄰近受體番茄植株的抗性.

不同小寫字母表示同一時間點各處理間差異顯著性(P<0.05).圖3 機械損傷處理供體番茄植株對有菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)連接的受體植株葉片和根系PAL和PR2基因的相對表達量的影響Fig.3 Relative expression levels of PAL and PR2 in the leaves and roots of tomato ‘receiver’ plants in response to mechanical damaged CMNs connected ‘donor’ plants

3 結(jié)論與討論

近年來已有研究表明，菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)可以參與地下資源的調(diào)節(jié).例如，通過放射性和穩(wěn)定性同位素證明CMNs可以在植株間傳遞磷[20]和氮[21]，并且這種傳遞是雙向的[22].在植物群落中，CMNs會依據(jù)不同植物對養(yǎng)分的需求程度來進行分配[23-24].CMNs不僅可以對地下營養(yǎng)物質(zhì)進行分配，還可以對水分[25-26]和化感物質(zhì)[27]等進行傳輸.由此可見，AM真菌能夠通過CMNs對土壤資源的重新分配，從而調(diào)節(jié)宿主植物之間的競爭[28]，進而能夠改變植物的群落動態(tài)，增加群落和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和多樣性[29-30].此外，謝麗君等[31]研究發(fā)現(xiàn)對供體番茄接種早疫病茄鏈格孢菌(Alternariasolani)后，供體植株通過地下部早已建立的CMNs將抗病信號傳遞給受體番茄植株，誘導(dǎo)受體番茄產(chǎn)生防御反應(yīng).郭濤等[32]研究發(fā)現(xiàn)受病害脅迫的供體煙苗能夠通過CMNs將脅迫信號傳遞給受體煙苗，進而增強受體煙苗的抗病性.還有研究表明CMNs還能夠介導(dǎo)抗蟲信號的傳遞，例如，Song et al[9]研究發(fā)現(xiàn)，對預(yù)先接種AM真菌并建立CMNs的番茄植株進行蟲害處理后，鄰近的未受蟲害取食的番茄植株的防御途徑被誘導(dǎo)激活，進而提高番茄抗蟲性.Babikova et al[27]研究發(fā)現(xiàn)蠶豆在被蚜蟲采食時，產(chǎn)生的化感物質(zhì)會通過CMNs傳遞給周圍的蠶豆植株，從而刺激周圍的蠶豆植株改變口感使蚜蟲不喜歡取食或者散發(fā)氣味吸引蚜蟲天敵到來，以殺滅蚜蟲.此外，研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌后，機械損傷處理可提高刺槐幼苗POD和PAL活性，而且所形成的CMNs還可介導(dǎo)相應(yīng)防御信號的傳遞，誘導(dǎo)鄰近植株的POD和PAL活性提高[10].但目前關(guān)于CMNs介導(dǎo)的植物之間機械損傷信號傳遞的研究報道較少，本研究則分別從CMNs介導(dǎo)的受體番茄葉片和根系這兩方面系統(tǒng)的證明機械損傷信號確實可以通過CMNs傳遞給鄰居植物，從而使得周圍健康植物提前做好防御準備.

植物遭受機械損傷后會產(chǎn)生酚類、萜類、黃酮類和生物堿等一系列次生代謝物質(zhì)，這些次生代謝物質(zhì)主要通過苯丙烷類代謝途徑生成，PAL和PPO是催化這一途徑的關(guān)鍵酶，直接調(diào)控酚酸形成量和增加細胞壁木質(zhì)素抵抗機械壓力[33-34].比如當(dāng)植物遭受切割或傷害時，苯丙烷類代謝被激活，PAL和PPO活性迅速上升[33-34].SOD和POD是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶和活性氧清除劑，參與植物的防御反應(yīng)過程中[34].劉萌萌等[34]研究發(fā)現(xiàn)隨著機械損傷強度的增加，冷蒿植株內(nèi)抗氧化酶活性逐漸增強.作為植物體內(nèi)抗真菌病的重要物質(zhì)之一的β-1,3-葡聚糖酶可被多種生物因子和非生物因子誘導(dǎo)表達[35].本研究中，供體番茄植株被機械損傷后，與供體有CMNs連接的鄰近健康受體番茄(處理A)葉片中PAL、PPO、SOD和POD活性升高、PAL和PR2基因均在第3 h就被快速誘導(dǎo)表達.與此同時，受體番茄根系中PAL和PR2基因也在6 h被誘導(dǎo)表達.分別比供體進行機械損傷但無CMNs連接的處理B、供體進行機械損傷但CMNs連接被阻斷的處理C以及有CMNs連接，但供體未進行機械損傷處理D表達水平要高.可見，在接種Fm建立CMNs后，當(dāng)供體植物受到機械損傷，可將這種損傷信號通過CMNs傳遞給受體，并激活受體植株防御酶、抗氧化酶和防御相關(guān)基因的表達，來提高植物的防御反應(yīng).本試驗中處理B、C和D分別排除了番茄根系分泌物的影響、番茄地上部揮發(fā)物的影響和Fm侵染本身的影響，如果是由這3種途徑介導(dǎo)的植物間的通訊，那么處理B、C和D的受體番茄植物葉片和根系的防御反應(yīng)應(yīng)該與處理A相同.試驗結(jié)果表明只有處理A的受體番茄植株的防御反應(yīng)最強烈，證明了CMNs可介導(dǎo)番茄植物間機械損傷信號的通訊.

菌根是自然界中一種普遍存在的植物互惠共生現(xiàn)象，而CMNs把很多植物聯(lián)系在一起.前人已發(fā)現(xiàn)CMNs是植物在地下進行物質(zhì)能量交換、生物脅迫信號傳遞的通道[15,24-25,33].CMNs介導(dǎo)的通訊比揮發(fā)物要穩(wěn)定得多，不容易受天氣影響，可以傳輸更遠的距離，并且菌根可以促進植物生長.因此，地下CMNs介導(dǎo)的植株間通訊比前人發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)物介導(dǎo)的植株間通訊更具有優(yōu)越性.本研究發(fā)現(xiàn)CMNs可以作為番茄植株間機械損傷信號傳遞的通道，豐富了我們對植物通過CMNs進行地下通訊的認知，但人們對CMNs如何介導(dǎo)各種生物脅迫信號傳遞的深入分子機制至今仍知之甚少，回答這些問題對菌根生物學(xué)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐都具有重大的意義.