馬玉仙, 蔣慧穎, 曾文治, 雷鄭延, 周 歡, 劉芷君, 倪 莉, 楊江帆

(1.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002;2.福州大學生物科學與工程學院食品科技研究所，福建 福州 350108)

現(xiàn)有的研究表明，腸道菌群與宿主之間具有相互作用的關(guān)系，健康人體腸道微生物的種類豐富，微生態(tài)穩(wěn)定；而腸道菌群失衡則會引起一系列炎癥的發(fā)生，進而使得宿主發(fā)生多種疾病[1-2].糖尿病是一類代謝性的疾病，發(fā)生原因復(fù)雜.越來越多的學者研究表明，腸道菌群與糖尿病之間有一定的相關(guān)性，從腸道菌群的角度來研究糖尿病已經(jīng)成為一種趨勢[3].鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)是一種常見的致糖尿病的藥物，具有造模率高、操作簡單、模型穩(wěn)定性好等特點.茶葉含有茶多酚、茶氨酸等天然活性物質(zhì)，具有減肥降脂、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群、降血糖等功效[4-6]，目前國內(nèi)外對茶葉保健功效的研究很多，而關(guān)于茶葉調(diào)節(jié)糖尿病腸道菌群的研究寥寥無幾.因此，本試驗選取具有福建特色的武夷巖茶作為試驗材料，試圖探明茶葉對糖尿病大鼠腸道菌群的影響，旨在為茶葉降糖的深入研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及茶樣 SPF級健康成年雄性Wistar大鼠重(200±20) g，由上海斯萊克試驗有限責任公司供應(yīng)[許可證號：SCXK(滬)2012-0002]，飼養(yǎng)地點在福建醫(yī)科大學試驗中心屏障動物試驗室.大鼠飼養(yǎng)環(huán)境室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，明暗交替條件為12 h∶12 h. 武夷巖茶采購于武夷山正山世家茶業(yè)有限公司.

1.1.2 試劑 氯仿分析純采購于江蘇南通聯(lián)海生物科技有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328)采購于北京天根生化科技有限公司；STZ(批號：S0130-1G)、檸檬酸、檸檬酸鈉采購于北京博愛科貿(mào)有限公司.

1.1.3 儀器與設(shè)備 儀器與設(shè)備有AR5120 Sartorius電子分析天平(上海創(chuàng)未生物技術(shù)有限公司)、 5417R型高速離心機(德國Eppendorf公司)、TGL-16臺式高效速冷離心機(湘儀離心機儀器有限公司)、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、 ULT1386-5-V41型-80 ℃超低溫冰箱(賽默飛世爾科技有限公司)、GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司)、SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(上海蘇凈實業(yè)有限公司)、WSZ-160A型漩渦振蕩器(上海一恒科技有限公司)、YXOSG41280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海醫(yī)用核子儀器廠).

1.2 武夷巖茶茶湯的制備

取100 g武夷巖茶，沸水浸提3次，茶水比分別為1∶20、1∶20、1∶10，提取時間分別為20、20、10 min，合并提取液，減壓低溫至(60±1) ℃，濃縮至100 mL，裝瓶滅菌放至冰箱(4 ℃)中備用.灌胃前，將提取液搖勻使用[7].

1.3 STZ的配制

1.3.1 檸檬酸的配制 在2.1 g檸檬酸中加入100 mL雙蒸水配制0.1 mol·L-1檸檬酸.

1.3.2 檸檬酸鈉的配制 在2.94 g檸檬酸鈉中加入100 mL雙蒸水配制0.1 mol·L-1檸檬酸鈉.

1.3.3 檸檬酸緩沖液的配制 28 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸與22 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸鈉混合后，用雙蒸水定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至4.2.

1.3.4 STZ的配制 在避光條件下，將STZ溶解于0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液中，配制成的1% STZ置于冰浴上，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.4 動物造模及分組

1.4.1 造模 將50只雄性健康大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周.隨機選取10只作為正常對照組，剩余40只作為試驗組.試驗組大鼠禁食24 h，連續(xù)2 d腹腔注射STZ，每次劑量30 mg·kg-1[8].正常對照組大鼠持續(xù)2 d腹部注射相同劑量的檸檬酸緩沖液.注射72 h后，大鼠禁食8 h，檢測大鼠尾靜脈血糖，當血糖值≧16.7 mmol·L-1，且伴隨著“三多一少”癥狀(多飲，多食，多尿，體重減少)，即造模成功.

1)武夷巖茶的劑量均以大鼠體重來計算.

1.4.2 動物分組 將糖尿病大鼠隨機分成武夷巖茶高、中、低劑量組和模型對照組.按表1的劑量[9]，連續(xù)灌胃30 d.

1.5 腸道內(nèi)容物的采集

30 d后，結(jié)束灌胃.大鼠空腹12 h，腹腔注射2 mL·kg-1水合氯醛進行麻醉，以剖開腹腔的方式處死大鼠，收集大鼠盲腸的腸道內(nèi)容物，放在冰箱(-80 ℃)中備用.

1.6 腸道內(nèi)容物DNA的提取和Illumina高通量測序

采用DNA提取試劑盒提取腸道內(nèi)容物DNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，提取的DNA置-20 ℃條件下保存[10].取適量DNA樣品于離心管中，用無菌水將樣品稀釋至1 ng·μL-1，根據(jù)V3～V4區(qū)序列，合成帶有Barcode的特異引物，引物序列為515F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)，以稀釋后的基因組DNA為模板，進行PCR擴增.根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，回收目的條帶.將PCR產(chǎn)物送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司建庫，使用HiSeq2500 PE250測序平臺進行上機測序.

將測序得到的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，除去低質(zhì)量的序列，得到有效數(shù)據(jù).利用Uparse軟件，對所有組別的全部有效序列進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTU，進一步將 OTU的代表序列進行物種注釋，將其結(jié)果繪制成稀疏曲線.基于樣品測序產(chǎn)生的OTU結(jié)果，對單個樣品的物種豐度(包含Chao指數(shù)、ACE指數(shù))進行分析，計算單個樣本的Alpha多樣性(即Shannon指數(shù))，指數(shù)的大小對應(yīng)著樣本中物種的多樣性豐富程度，二者呈正比.

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件分析，并進行t檢驗，以平均值±標準差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠腸道內(nèi)容物DNA的測序基本數(shù)據(jù)

提取正常對照組，模型對照組，武夷巖茶高、中、低劑量組5組大鼠腸道內(nèi)容物的DNA，采用Illumina HiSeq測序平臺進行測序，在16S rDNA V3～V4區(qū)中獲得的高質(zhì)量序列數(shù)為3 387 619條，樣本序列數(shù)為62 422～79 397條，平均序列數(shù)為72 077條，平均序列長度為409 bp.由圖1的稀釋曲線可知，各組OTU數(shù)量的變化與測序數(shù)量的增長呈正比，增大的幅度會隨著測序數(shù)量的增加而逐漸變緩，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中的所有物種.

圖1 腸道菌群的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve analysis of intestinal microflora

2.2 大鼠腸道菌群物種的豐度與多樣性

OTU數(shù)量[11]表示大鼠腸道內(nèi)容物中微生物的豐度，數(shù)值越大表明微生物越豐富.從表2可知，與正常對照組相比，糖尿病組大鼠的OTU數(shù)量顯著增加(P<0.05)，武夷巖茶各劑量組可以顯著抑制這種趨勢，其抑制效果與武夷巖茶的劑量呈正相關(guān).

表2 大鼠腸道內(nèi)容物的OTU數(shù)量及Alpha多樣性1)Table 2 OTU number and Alpha diversity of fecal microflora in all groups

1)與模型對照組比較，*表示P<0.05；與正常對照組比，#表示P<0.05.

ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)越大表明腸道菌群結(jié)構(gòu)的豐度越高，多樣性越豐富[12].表2顯示：與正常對照組相比，模型對照組大鼠的ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)顯著升高(P<0.05)，而武夷巖茶各劑量組的豐度均低于模型對照組，其中，武夷巖茶高劑量組的ACE指數(shù)顯著低于模型對照組(P<0.05)，表明武夷巖茶可以降低糖尿病大鼠腸道菌群的豐度.與正常對照組相比，糖尿病大鼠的Shannon指數(shù)顯著上升(P<0.05)，武夷巖茶各劑量組則抑制了這種趨勢，其中，武夷巖茶高劑量組的效果顯著(P<0.05).可見，糖尿病顯著提高了大鼠腸道菌群的多樣性，而武夷巖茶可以抑制這種趨勢，其中以武夷巖茶高劑量組的效果最佳.

2.3 大鼠腸道的整體群落結(jié)構(gòu)

圖2顯示，各組大鼠腸道微生物在門的水平組成上主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門等，其中，厚壁菌門和擬桿菌門約占序列總數(shù)的80%.與正常對照組(29.2%)相比，糖尿病組大鼠的擬桿菌門含量顯著降低至20.7%(P<0.05)，武夷巖茶各劑量組則有效抑制了這種現(xiàn)象，其中以武夷巖茶高劑量組的抑制效果最為顯著(P<0.05)，擬桿菌門的含量為25.7%；與正常對照組(4.06%)相比，糖尿病組變形菌門的含量增加至13.19%(P<0.05)，灌胃武夷巖茶后，變形菌門的相對豐度均下降，其中以武夷巖茶高劑量組的效果最為顯著(P<0.05)，變形菌門的含量為6.09%.

圖2 門水平上大鼠腸道菌群的分布Fig.2 Relative abundance of rat intestinal microflora at phylum level

圖3顯示，在屬的水平上，各組大鼠腸道微生物相對豐度較高的為乳酸桿菌屬.Allobaculum是一種有益菌，對腸道具有一定的保護作用.糖尿病組大鼠的腸桿菌屬含量由正常對照組的0.13%上升至0.32%，埃希氏菌—志賀菌氏屬含量由正常對照組的0.29%上升至2.39%，克里斯滕森氏菌屬含量由正常對照組的2.43%上升至8.00%，這3種屬的含量都明顯上升(P<0.05)；糖尿病組大鼠的Romboutsia含量由正常對照組的10.06%下降至5.07%，瘤胃球菌屬含量由正常對照組的1.67%下降至1.0%，雙歧桿菌屬含量由正常對照組的0.6%下降至0.1%，Allobaculum含量由正常對照組的4.15%下降至了1.0%，這4種屬的含量下降明顯(P<0.05).灌胃武夷巖茶后，糖尿病大鼠的腸道菌群開始恢復(fù)正常，其中以武夷巖茶高劑量組的效果顯著，表明武夷巖茶能改善糖尿病大鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu).

圖3 屬水平上大鼠腸道菌群的分布Fig.3 Relative abundance of rat intestinal microflora at genus level

2.4 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性

將屬水平豐度排名在前25的菌群，以不同組間豐度相似性聚類的方式制作熱圖.熱圖是通過不同顏色來反映各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的相似性和差異性，樣品聚類樹為各組大鼠間基于群落組成的層次聚類分析結(jié)果.從樣品聚類樹和各組菌群的顏色(圖4)可以看出，糖尿病組與正常對照組的差異顯著，武夷巖茶各劑量組與模型對照組之間具有差異性，武夷巖茶高劑量組與中劑量組的相似性較高.表明武夷巖茶能改善糖尿病大鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu)，其中以武夷巖茶高劑量的改善效果好.

圖4 大鼠腸道菌群的熱圖和聚類樹Fig.4 Heat map analysis of rat intestinal flora

3 討論

本試驗以武夷巖茶為研究對象，采用高通量測序技術(shù)檢測糖尿病大鼠腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腸道菌群的多樣性明顯高于正常對照組(P<0.05)，這與張芹等[13]的研究結(jié)果一致.對糖尿病大鼠灌胃不同劑量的武夷巖茶后，其腸道菌群的多樣性顯著降低(P<0.05)，且多樣性的減少與武夷巖茶的劑量呈正相關(guān).同時，本試驗還發(fā)現(xiàn)糖尿病的發(fā)生會引起腸道菌群的失調(diào)，這與李先鋒等[14]、肖黨生等[15]的研究結(jié)果一致，證明糖尿病的發(fā)生影響了腸道菌群的種類和數(shù)量，而腸道菌群在糖尿病的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用.

腸道菌群中擬桿菌門和厚壁菌門的豐度與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，它們主要參與了腸道內(nèi)糖、脂的代謝等過程，對宿主的健康起重要作用[16-17].王雯玲[18]研究表明，糖尿病大鼠擬桿菌門和厚壁菌門的數(shù)量顯著下降，變形菌門的數(shù)量減少.Larsen et al[19]對糖尿病患者腸道菌群的研究表明，糖尿病患者中擬桿菌的數(shù)量顯著減少，與本試驗的研究結(jié)果一致.而本試驗灌胃武夷巖茶后，相對于模型對照組大鼠，武夷巖茶組大鼠體內(nèi)擬桿菌門的相對豐度增大，變形菌門的相對豐度減小，推測這可能與武夷巖茶的降糖作用有關(guān).乳酸桿菌會調(diào)節(jié)腸道的pH，同時產(chǎn)生H2O2抑制病原菌在腸道內(nèi)的增值，以保持腸道微生態(tài)的平衡.劉婷婷[20]對比2型糖尿病患者與正常對照人群，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腸道的乳酸桿菌數(shù)量顯著高于正常對照人群(P<0.001)；而本試驗結(jié)果表明，正常對照組大鼠腸道的乳酸桿菌相對豐度高于模型對照組，與張芹等[13]的研究結(jié)果一致.陳佩等[21]對糖尿病小鼠灌胃鼠李糖乳酸桿菌的結(jié)果表明，鼠李糖乳酸桿菌可顯著降低糖尿病小鼠的血糖含量.圖3、4顯示，灌胃武夷巖茶后，乳酸桿菌、Allobaculum、腸桿菌、瘤胃球菌的相對豐度都有所恢復(fù)，其中，武夷巖茶高劑量組的相對豐度接近于正常對照組，揭示了武夷巖茶可能是通過對這些菌的調(diào)節(jié)作用，起到降低大鼠血糖的效果.

本試驗結(jié)果表明，糖尿病大鼠的腸道菌群出現(xiàn)了失調(diào)現(xiàn)象，武夷巖茶可以調(diào)節(jié)這種現(xiàn)象，調(diào)節(jié)作用與武夷巖茶的劑量呈正相關(guān).