張清華, 陸 芝, 張曉陽, 劉宏毅, 丁 奕, 葉小真, 馮麗貞

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院/福建農(nóng)林大學(xué)森林保護研究所，福建 福州 350002)

殺菌劑的大量使用導(dǎo)致病原真菌對化學(xué)藥劑逐漸產(chǎn)生抗性，病原真菌的多藥耐藥性已成為動植物真菌病害的治療和防治過程中最急需解決的難題.多藥耐藥轉(zhuǎn)運蛋白MDR(multidrug resistance)主要與多藥耐藥性相關(guān)，可通過將外源化學(xué)物質(zhì)排出體外，減少外源化學(xué)物質(zhì)對真菌的毒害作用或使病原真菌能夠成功定植到寄主中.MDR轉(zhuǎn)運蛋白屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族.MDR轉(zhuǎn)運蛋白廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，其功能獲得了較為廣泛的研究，如煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的Mdr1蛋白、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)AtrD蛋白和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的Pmd1蛋白[1-3].植物病原真菌MDR轉(zhuǎn)運蛋白除與多藥耐藥性相關(guān)外，還與其致病過程，如稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)ABC3(MGG_13762)蛋白與病原菌穿透寄主的過程有關(guān)[4].小麥赤霉菌(Fusariumgraminearum)FGSG_06771基因突變體菌株的致病力明顯下降[5].

桉樹焦枯病(Calonectrialeaf blight)是熱帶和亞熱帶地區(qū)為害桉樹生長的重要病害之一，嚴(yán)重威脅桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6].桉樹焦枯病由麗赤殼屬(Calonectriaspp.)真菌引起，其無性態(tài)為帚梗柱孢屬(Cylindrocladium)[7].據(jù)統(tǒng)計，Calonectria現(xiàn)有集群13個，共71種，其中CalonectriapseudoreteaudiiYA51是福建省內(nèi)分布最廣、致病力最強的病原菌株[8-10].研究發(fā)現(xiàn)桉樹焦枯病菌CpABCB7基因在焦枯病菌侵染桉樹48 h時上調(diào)表達，且在67個ABC基因中表達量最高.CpABCB7屬于多藥耐藥蛋白MDR，桉樹焦枯病菌中共有12個MDR蛋白[11].為了解MDR蛋白在桉樹焦枯病菌的具體功能，本研究通過生物信息軟件對桉樹焦枯病菌MDR蛋白家族的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)進行分析，進一步通過qPCR檢測在分生孢子階段、孢子萌發(fā)階段、桉樹焦枯病菌接種24、48和72 h后及焦枯病菌在H2O2、NaCl、KCl、LiCl、放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑脅迫下的表達情況，研究結(jié)果可為解析MDR基因的具體功能提供數(shù)據(jù)支撐，也可為闡述MDR基因與桉樹焦枯病菌致病和抗藥分子機制之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為C.pseudoreteaudiiYA51，由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護研究所于福建永安桉樹焦枯病危害區(qū)采集分離獲得.基因組NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索編號MOCD 01000000.

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司；NaCl、KCl、H2O2、葡萄糖和硼酸購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；百菌清、放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿和咪康唑購自上海源葉生物科技有限公司.真菌培養(yǎng)采用PDB培養(yǎng)基，200 g 去皮土豆，20 g葡萄糖； 每升PDB液體培養(yǎng)基加15 g瓊脂粉，制備PDA培養(yǎng)基.

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性測定 放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿和咪康唑用乙醇溶解，配成100 mg·mL-1母液，4 ℃保存?zhèn)溆?；百菌清用丙酮配置?0 mg·mL-1母液，4 ℃保存?zhèn)溆?將5種藥物根據(jù)表1配置10倍液.待PDA培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃后，將配置好的10倍液分別與PDA培養(yǎng)基以1∶9的比例充分混勻，制成含藥平板.

表1藥物濃度梯度
Table 1 The gradients of drugs mg·mL-1

藥物梯度一梯度二梯度三梯度四梯度五放線菌酮10.10.010.0010.000 1苦參堿 105.02.501.2500.675 0蘆竹堿 105.02.501.2500.675 0咪康唑 101.00.100.0100.001 0百菌清 30.30.030.0030.000 3

將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)10 d后，在菌落邊緣打取直徑6.0 mm的菌餅，并分別接種于1.4.1制好的含藥PDA平板的中央，菌絲面朝下，以加了等量無菌水的無藥PDA平板為對照，每處理重復(fù)3次.28 ℃培養(yǎng)10 d后用十字交叉法測量菌落直徑，按公式(1)計算菌絲生長抑制率.將濃度梯度值的菌絲生長抑制率，將抑制率轉(zhuǎn)換為相應(yīng)幾率值，采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行回歸分析，分別計算5種殺菌劑的EC50.

(1)

1.2.2 生物信息學(xué)分析 通過ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析其理化性質(zhì).采用PBIL(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/services/secondaryStructurePred-iction)在線分析工具PHD分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，該分析基于ASTP和MaxHom.然后采用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對MDR基因編碼的蛋白序列進行分析，并結(jié)合SWISS-MODEL(https://swismodel.expasy.org/interactive)在線服務(wù)對MDR蛋白三級結(jié)構(gòu)進行分析.最后，用SAVES(https://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)在線服務(wù)對所構(gòu)建的MDR蛋白三級結(jié)構(gòu)進行驗證.

1.2.3MDR基因表達分析 焦枯病菌侵染桉樹葉片處理：同葉小真等[12]的方法.

藥物脅迫：將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.根據(jù)1.4中計算出的5種藥物的EC50配置含藥PDB培養(yǎng)基.取邊緣部位菌餅接種于含藥培養(yǎng)基中，以加入無菌水的培養(yǎng)基作為對照組，每個錐形瓶中加入3個菌餅，置于恒溫振蕩器中28 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h.每個處理設(shè)置3個生物重復(fù).振蕩培養(yǎng)12 h后，用Miracloth收集菌絲并用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

氧脅迫：將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.取邊緣部位菌餅接種于H2O2濃度為8 mmol·L-1的YEPD培養(yǎng)基中，以無菌水的YEPD培養(yǎng)基作為對照組，每個錐形瓶中加入3個菌餅，置于恒溫振蕩器中28 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h.每個處理設(shè)置3個生物重復(fù).振蕩培養(yǎng)12 h后，用Miracloth收集菌絲并用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

金屬鹽脅迫：將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.取邊緣部位菌餅接種于分別含有0.8 mol·L-1NaCl、0.6 mol·L-1KCl、0.1 mol·L-1LiCl的YEPD培養(yǎng)基中，以加入無菌水的YEPD培養(yǎng)基作為對照組，每個錐形瓶中加入3個菌餅，置于恒溫振蕩器中28 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h.每個處理設(shè)置3個生物重復(fù).振蕩培養(yǎng)12 h后，用Miracloth收集菌絲并用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

分生孢子樣品制備：將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.取邊緣部位菌餅接種于改良PDA培養(yǎng)基(土豆40 g·L-1)中，振蕩培養(yǎng)4 d后離心去上清，沉淀物用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

分生孢子萌發(fā)階段樣品制備：桉樹焦枯病菌侵染寄主過程中，主要通過自然孔口進入桉樹體內(nèi)[13]，暫未發(fā)現(xiàn)其他侵染結(jié)構(gòu)；此外，焦枯病菌在葉片表面4 h即萌發(fā)[14,15].因此，本研究主要從分生孢子階段和孢子萌發(fā)階段(振蕩培養(yǎng)4 h)來檢測MDR基因的表達情況.將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.取邊緣部位菌餅接種于改良PDB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)4 d后過濾，收集孢子，將孢子加入YEPD培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)濃度為2×10-7spores·mL-1.置于恒溫振蕩器中28 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 h，離心去上清后，用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

采用1.7.1的樣品制備方法，總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司.采用Talent qPCR PreMix試劑盒進行qPCR，反應(yīng)體系為：2×Talent qPCR Mix 10.0 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，cDNA模板1.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，并加RNase-Free ddH2O至20 μL.引物設(shè)計采用Primer premier 6.0軟件進行設(shè)計(表2)，委托生工生物工程有限公司合成.采用2-△△Ct法計算焦枯病菌MDR基因的表達量.

表2 桉樹焦枯病菌內(nèi)參基因及其對應(yīng)引物Table 2 The primer of reference gene in C.pseudoreteaudii

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對桉樹焦枯病菌菌絲生長的抑制作用

采用SPSS軟件分析放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑?qū)﹁駱浣箍莶【z生長的抑制作用，結(jié)果表明，5種藥劑的不同濃度梯度均能影響桉樹焦枯病菌的菌絲生長量，且這種抑制作用與濃度呈正相關(guān)，濃度越高菌落直徑越小、抑制率越高，且存在顯著性差異(P<0.05)，說明分析結(jié)果具有生物學(xué)統(tǒng)計意義.放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑原藥對桉樹焦枯病菌的EC50分別為0.27、4.00、2.01、2.16和3.73 mg·mL-1.

2.2 MDR轉(zhuǎn)運蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線分析MDR轉(zhuǎn)運蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，MDR轉(zhuǎn)運蛋白中，除CpABCB12的氨基酸酸殘基數(shù)為492 aa外，其余11個MDR轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸殘基數(shù)均在1100個以上.除CpABCB12外，其余11個MDR蛋白的分子質(zhì)量均相差不大.其中，CpABCB1最大，分子質(zhì)量為149804.34 u；在等電點處，庫倫相互作用最小，有利于不同蛋白間接觸.通過預(yù)測，MDR蛋白的理論等電點為5.48～8.76，CpABCB12轉(zhuǎn)運蛋白的等電點偏堿性，而CpABCB1～CpABCB11轉(zhuǎn)運蛋白的等電點偏酸性；當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)>40時，該蛋白不穩(wěn)定蛋白，通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)除CpABCB4(不穩(wěn)定系數(shù)40.18)屬于不穩(wěn)定蛋白外，其余MDR蛋白均屬于穩(wěn)定蛋白；MDR蛋白的平均疏水性(grand average of hydropathicity, GRAVY)值均>0，表明MDR蛋白均為疏水性蛋白(表3).

表3 MDR轉(zhuǎn)運蛋白理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of MDR transporter

2.3 MDR蛋白結(jié)構(gòu)分析

桉樹焦枯病菌MDR轉(zhuǎn)運蛋白的二級結(jié)構(gòu)采用PHIL的PHD在線服務(wù)進行分析，結(jié)果表明桉樹焦枯病菌MDR轉(zhuǎn)運的蛋白的組成均相同，分別為α-螺旋(α-helix)、β-折疊(β-sheet)和無規(guī)則卷曲(random coil).且桉樹焦枯病菌MDR轉(zhuǎn)運蛋白α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲的占比差異性不大，占比從高到低的排列順序為α-螺旋>無規(guī)則卷曲>β-折疊(圖1).從分布上來說，CpABCB1～CpABCB11轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)域為(TMD-NBD)2，α-螺旋和β-折疊均勻分布在N端和C端.而CpABCB12的結(jié)構(gòu)域為TMD-NBD，α-螺旋主要分布在N端.桉樹焦枯病菌MDR轉(zhuǎn)運蛋白的三級結(jié)構(gòu)采用Swiss-model在線功能進行預(yù)測分析，結(jié)果共獲得12個MDR轉(zhuǎn)運蛋白的預(yù)測模型，預(yù)測結(jié)果與前面的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)基本一致(圖2).CpABCB1～CpABCB11轉(zhuǎn)運蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由2個TMD結(jié)構(gòu)域和2個NBD結(jié)構(gòu)域組成，且N端和C端各有1個TMD結(jié)構(gòu)和1個NBD結(jié)構(gòu).而CpABCB12轉(zhuǎn)運蛋白只有1個TMD結(jié)構(gòu)和1個NBD結(jié)構(gòu)，N端為TMD，C端為NBD，半分子ABCB轉(zhuǎn)運蛋白的NBD及TMD結(jié)構(gòu)域可通過形成二聚體行使功能.上述結(jié)果說明這12個MDR轉(zhuǎn)運蛋白均有明顯的ABC轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)特征，因而具有MDR轉(zhuǎn)運蛋白的活性和功能.

采用SAVES在線軟件對12個MDR轉(zhuǎn)運蛋白的預(yù)測結(jié)構(gòu)進行質(zhì)量評估，由拉氏構(gòu)象(Ramachandran Plot)發(fā)現(xiàn)，除CpABCB10轉(zhuǎn)運蛋白核心區(qū)域的殘基位點僅占85.9%以外，其余MDR轉(zhuǎn)運蛋白核心區(qū)域的殘基位點均占90%以上.3D-1D Score>0.2的殘基位點占65%以上即可證明，二面角是合理的氨基酸殘基占絕大多數(shù)，具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，為合理的模型.所有MDR轉(zhuǎn)運蛋白的3D-1D Score>0.2的殘基位點均占80%以上.上述結(jié)果表明，Swiss-model預(yù)測的12個MDR轉(zhuǎn)運蛋白均具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，所預(yù)測的模型合理.

圖1 MDR轉(zhuǎn)運蛋白二級結(jié)構(gòu)占比Fig.1 Proportion of secondary structure of MDR transporter

圖2 MDR轉(zhuǎn)運蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.2 3D structure of MDR transporter

2.4 MDR基因表達分析

2.4.1 總RNA濃度及質(zhì)量檢測 超微量分光光度計檢測結(jié)果顯示，提取的RNA濃度在390至3100 μg·μL-1范圍內(nèi)，D260 nm/D280 nm均在1.8至2.2范圍內(nèi)，RNA無降解，純度較好.總RNA的濃度和純度均滿足后續(xù)實驗要求.

2.4.2 凝膠電泳檢測結(jié)果 總RNA凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，總RNA具有典型的3種帶型(28s、18s和5s)，無可見的DNA污染.且條帶是清晰并無拖拽的，表明提取的總RNA完整性良好，滿足后續(xù)試驗.

M為marker，1為CK1，2為H2O2，3為NaCl，4為KCl，5為LiCl，6為CK2，7為放線菌酮，8為苦參堿，9為蘆竹堿，10為百菌清，11為孢子階段，12為萌發(fā)階段，13為接種48 h的對照組，14為接種48 h，15為CK3，16為接種24 h，17為CK4，18為接種，19為咪康唑.圖3 總RNA凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of total RNA

2.4.3MDR基因表達分析 采用qPCR的方法分析桉樹焦枯病菌在分生孢子階段、分生孢子萌發(fā)階段、桉樹焦枯病菌接種桉樹葉片24、48和72 h后及焦枯病菌在含H2O2、NaCl、KCl、LiCl、放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑誘導(dǎo)下的表達情況.采用-△△Ct進行計算，并采用生信人熱圖工具記錄12個MDR基因在14種條件下的表達情況.紅色代表下調(diào)表達，藍色代表上調(diào)表達，且顏色越深代表表達越顯著(圖4).結(jié)果表明，僅CpABCB10基因在分生孢子及分生孢子萌發(fā)階段上調(diào)表達.

圖4 MDR基因不同誘導(dǎo)條件下的表達情況Fig.4 The expression levels of MDR genes under different induction conditions

MDR基因在NaCl、KCl和LiCl條件下均發(fā)生不同程度的表達.NaCl和KCl脅迫下，均有5個MDR基因發(fā)生上調(diào)表達，1個基因發(fā)生上調(diào)表達.其中，CpABCB4基因在NaCl脅迫下表達倍數(shù)最高.KCl脅迫下CpABCB4和CpABCB5基因的表達情況均有較高的表達倍數(shù)；LiCl脅迫下，僅有2個基因發(fā)生上調(diào)表達，4個基因發(fā)生下調(diào)表達，且上調(diào)表達的CpABCB4和CpABCB9基因均不顯著.

氧脅迫下，僅有CpABCB1基因在H2O2誘導(dǎo)下發(fā)生下調(diào)表達，CpABCB4、CpABCB6、CpABCB7、CpABCB8、CpABCB9和CpABCB11基因均發(fā)生上調(diào)表達.其中，CpABCB11基因的表達量最高.上述結(jié)果說明，CpABCB4、CpABCB6、CpABCB7、CpABCB8、CpABCB9和CpABCB11基因均能介導(dǎo)氧脅迫，且CpABCB11基因發(fā)揮主要作用.

MDR基因在放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑脅迫下均發(fā)生不同程度的表達.百菌清誘導(dǎo)下，共有6個MDR基因發(fā)生上調(diào)表達，5個MDR基因發(fā)生下調(diào)表達，CpABCB8基因的表達倍數(shù)遠(yuǎn)高于其他MDR基因.放線菌酮誘導(dǎo)下，除CpABCB3基因外，其余MDR基因均發(fā)生上調(diào)表達.苦參堿和蘆竹堿誘導(dǎo)下，分別有5個和6個基因發(fā)生上調(diào)表達，且均有4個基因發(fā)生下調(diào)表達.同時，表達倍數(shù)最高的均為CpABCB7基因.在咪康唑誘導(dǎo)下，共有6個基因發(fā)生上調(diào)表達，3個基因發(fā)生下調(diào)表達，且表達倍數(shù)最高的為CpABCB2基因.此外，有且僅有CpABCB7和CpABCB8基因在5種藥物誘導(dǎo)下均發(fā)生表達.有部分基因在3種或4種藥物誘導(dǎo)下能夠上調(diào)表達，多數(shù)基因均能在2種及2種以上的藥物誘導(dǎo)下發(fā)生上調(diào)表達.上述結(jié)果表明，CpABCB7和CpABCB8基因與桉樹焦枯病菌對這5種藥物的交替抗藥性存在一定關(guān)聯(lián)，還有部分基因與桉樹焦枯病菌對3種或4種藥物的交替抗藥性存在一定關(guān)聯(lián).

圖5 MDR基因不同侵染階段趨勢圖Fig.5 Trend plot of MDR gene at various infection stages

MDR基因在桉樹焦枯病菌接種24 h、48 h和72 h后均發(fā)生不同程度的表達，不同基因在不同侵染階段的表達趨勢有所不同.圖5顯示，桉樹焦枯病菌接種24 h后，僅有CpABCB7基因發(fā)生上調(diào)表達.桉樹焦枯病菌接種48 h后，上調(diào)表達的基因由1個變?yōu)?個，除CpABCB7基因外，CpABCB1和CpABCB8基因也發(fā)生上調(diào)表達，且CpABCB7基因的表達倍數(shù)最高.樹焦枯病菌接種72 h后，上調(diào)表達的基因增加至5個，CpABCB1和CpABCB7基因仍然發(fā)生上調(diào)達標(biāo)，CpABCB8基因由上調(diào)表達變?yōu)橄抡{(diào)表達，CpABCB6、CpABCB9和CpABCB12基因在此階段發(fā)生上調(diào)表達.在桉樹焦枯病菌接種24 h、48 h和72 h這3個階段中，僅CpABCB7基因均發(fā)生上調(diào)表達，且表達倍數(shù)在這3個階段均為最高，表達趨勢先上升后下降.上述結(jié)果說明，CpABCB8基因桉樹焦枯病菌僅在接種24 h后發(fā)揮作用；CpABCB1基因可能在桉樹焦枯病菌接種24 h、48 h發(fā)揮較為重要的作用；桉樹焦枯病菌接種72 h時，CpABCB6、CpABCB9和CpABCB12基因均可能發(fā)揮作用.

3 結(jié)論與討論

MDR轉(zhuǎn)運蛋白廣泛存在于植物病原真菌中，主要分布于菌體細(xì)胞膜上，其功能主要與多藥抗藥性有關(guān)，通過轉(zhuǎn)運抗真菌藥物獲得毒素以達到對真菌起到保護作用.本研究共從桉樹焦枯病菌C.pseudoreteaudiiYA51全基因組進發(fā)現(xiàn)12個MDR轉(zhuǎn)運蛋白.MDR轉(zhuǎn)運蛋白屬于ABCB亞族，其全分子結(jié)構(gòu)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)應(yīng)為(TMD-NBD)2型，除CpABCB12是結(jié)構(gòu)為TMD-NBD半分子ABCB轉(zhuǎn)運蛋白外，其余均為全分子[11].蛋白功能與蛋白結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，為了解MDR轉(zhuǎn)運蛋白的功能與結(jié)構(gòu)間聯(lián)系，本研究通過對二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，初步獲得MDR轉(zhuǎn)運蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果.且所預(yù)測的12個MDR轉(zhuǎn)運蛋白的均具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，所預(yù)測模型均是合理的.三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)為典型的ABC轉(zhuǎn)運蛋白[16-19]，說明MDR基因的進化關(guān)系較為保守.

為解析MDR基因參與調(diào)控桉樹焦枯病菌的具體功能，通過qPCR檢測12個MDR基因在不同條件下的表達情況.結(jié)果表明，桉樹焦枯病菌MDR基因在各種條件下均發(fā)生不同程度的表達.稻瘟菌ABC4基因被證明與芽管的萌發(fā)有關(guān)[20]，稻瘟菌MoABC5、MoABC6和MoABC7基因也可參與維持分生孢子的穩(wěn)定性[21].但尚未有研究表明ABCB基因參與調(diào)控芽管的萌發(fā).在孢子及孢子萌發(fā)階段，僅CpABCB10基因發(fā)生上調(diào)表達，說明桉樹焦枯病菌MDR基因中僅CpABCB10基因可能參與調(diào)控孢子萌發(fā).Zwiers et al[22]研究表明M.graminicola的MgAtr7基因與重金屬離子的轉(zhuǎn)運有關(guān)，且可通過該功能來維持菌體內(nèi)離子的動態(tài)平衡.稻瘟菌ABC4基因還與Na+離子的轉(zhuǎn)運有關(guān).為明確MDR基因與金屬離子的轉(zhuǎn)運之間是否存在聯(lián)系，通過qPCR對該功能進行初步研究，結(jié)果表明，MDR基因在3種離子條件下均有不同程度表達，NaCl條件下表達倍數(shù)最高的是CpABCB4基因，而KCl和LiCl條件下表達量最高的均是CpABCB9基因，說明CpABCB4和CpABCB9基因參與調(diào)控金屬離子的轉(zhuǎn)運，而其他基因可能發(fā)揮輔助作用或負(fù)調(diào)控作用.

隨著桉樹焦枯病菌的持續(xù)爆發(fā)，殺菌劑在防治過程中獲得廣泛應(yīng)用，這可能導(dǎo)致病原菌對殺菌劑的抗藥性持續(xù)增強.MDR轉(zhuǎn)運蛋白則可通過將殺菌劑轉(zhuǎn)運出病原菌體外來獲得抗藥性.樓天靈等的研究表明小麥赤霉菌在戊哇醇和樸海因處理后，F(xiàn)GSG_09697.3(MDR)基因的表達量比處理前分別上升了13.88倍和5.23倍，由該結(jié)果可知MDR基因與藥劑敏感性之間有一定聯(lián)系[5].粉紅粘帚霉(Gliocladiumroseum)IK726的ABC基因ABC3260在綠針假單胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)MA342發(fā)酵液誘導(dǎo)6 h后既發(fā)生上調(diào)表達等[23,24].而桉樹焦枯病菌在放線菌酮誘導(dǎo)下CpABCB11基因的表達倍數(shù)最高，在百菌清和咪康唑誘導(dǎo)下CpABCB8和CpABCB2基因中表達倍數(shù)最高.CpABCB7基因苦參堿、蘆竹堿中表達倍數(shù)均為最高.上述結(jié)果表明CpABCB7和CpABCB8基因可參與調(diào)控桉樹焦枯病菌對外源化學(xué)的交替抗藥性.

病原菌侵染寄主過程中，寄主可通過釋放大量H2O2和次生代謝物質(zhì)來抵抗病原菌的侵襲.Sun et al[4]研究表明稻瘟病菌ABC3轉(zhuǎn)運蛋白參與氧化應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)，并參與調(diào)控稻瘟病菌滲透和突破寄主.稻瘟菌MoABC5、MoABC6和MoABC7基因均可對H2O2產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng).通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，桉樹焦枯病菌中有多個MDR基因在H2O2條件下均發(fā)生上調(diào)表達.同時，樓天靈[5]通過對小麥赤霉菌MDR基因FGSG_06771.3的敲除發(fā)現(xiàn)，其致病能力顯著下降.稻瘟菌ABC3基因病原菌對寄主的突破和滲透相關(guān).本研究推測桉樹焦枯病菌MDR基因可能存在類似的機制.CpABCB1、CpABCB6、CpABC7、CpABCB8、CpABCB9基因在焦枯病菌侵染桉樹不同階段均發(fā)生不同程度的表達.此外，MDR基因除轉(zhuǎn)運殺菌劑外，還可通過轉(zhuǎn)運植物源化學(xué)物來避免其對自身的毒害作用，如灰霉菌BcatrB轉(zhuǎn)運蛋白在侵染擬南芥的過程中通過轉(zhuǎn)運擬南芥分泌的植保素(亞麻芥素)來現(xiàn)菌株對擬南芥的成功侵染[25].赤霉菌(Gibberellapulicaris)MDR轉(zhuǎn)運蛋白Gpabc1參與轉(zhuǎn)運馬鈴薯產(chǎn)生的抗真菌毒素，使其能夠抵御馬鈴薯塊莖產(chǎn)生的抗真菌毒素的毒害作用[26].MDR基因在植物源化學(xué)物苦參堿和蘆竹堿誘導(dǎo)下，分別有5個和6個基因發(fā)生上調(diào)表達.上述結(jié)果說明MDR基因可能與該機制有關(guān).此外，在H2O2、植物源化學(xué)物誘導(dǎo)下及侵染過程，有且僅有CpABCB7基因均發(fā)生上調(diào)表達，說明CpABCB7基因可參與桉樹焦枯病菌侵染寄主的整個過程.

上述結(jié)果表明，CpABCB10可能參與調(diào)控分生孢子穩(wěn)定性和孢子萌發(fā)，CpABCB4和CpABCB9基因可參與調(diào)控金屬離子的轉(zhuǎn)運，CpABCB7和CpABCB8基因參與調(diào)控桉樹焦枯病菌的抗藥機制.此外，CpABCB7基因還能參與調(diào)控桉樹焦枯病菌的整個致病過程.其余MDR基因發(fā)揮輔助作用或負(fù)調(diào)控作用.本結(jié)果為研究MDR基因的具體功能提供數(shù)據(jù)支撐，也可為研究MDR基因與桉樹焦枯病菌致病和抗藥分子機制之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ).