楊明泉,相 歡,王海萍,崔 春

(1.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司,廣東中山 528437;2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI),是從脫脂大豆中去除大豆纖維以及水溶性的非蛋白部分后得到的[1]。它具有較高的營養(yǎng)價值,并且原料豐富,現(xiàn)階段越來越多地被用于食品加工工業(yè)中,如飲料、焙烤食品、乳品、蛋白替代品、肉制品等,這與大豆分離蛋白的溶解性、分散性、持水性、起泡性、乳化性以及凝膠性等功能特性[2]密切相關(guān)。然而大豆分離蛋白自身的功能性質(zhì)不能完全滿足現(xiàn)代食品加工的需求,不同食品在加工的過程中需要適當(dāng)?shù)脑鰪娀蛘邷p弱某項功能,這就限制了大豆分離蛋白的應(yīng)用。因此,為了滿足食品加工工業(yè)的要求,對大豆分離蛋白進(jìn)行改性成為一個必要手段。

目前對于大豆分離蛋白,可以通過化學(xué)方法[3]、物理方法[4]、酶法[5]進(jìn)行改性。其中酶法改性是利用蛋白酶的內(nèi)切和外切作用,將蛋白質(zhì)切割成小分子,從而改變蛋白質(zhì)的功能特性,酶法改性的條件較為溫和,效率高,不會破壞氨基酸結(jié)構(gòu),并且產(chǎn)生有害物質(zhì)的可能性比較小,安全性較高[6]。目前的研究表明,蛋白質(zhì)適度酶解對于蛋白質(zhì)的改性有明顯的作用,常采用控制酶解技術(shù)來達(dá)到此目的。影響蛋白控制酶解的主要因素有:酶解溫度、酶與底物濃度比、pH、底物濃度等[7-8]。一般而言,常規(guī)酶解技術(shù)中底物蛋白質(zhì)的濃度在8%～16%之間。與常規(guī)濃度下的酶解技術(shù)相比,提高酶解體系中底物的固形物濃度(即高濃酶解體系)具有許多優(yōu)點,如終產(chǎn)物濃度高、廢水產(chǎn)量少、冷卻和濃縮能耗低、設(shè)備尺寸小等[9-10]。目前，利用蛋白酶控制酶解技術(shù)對大豆蛋白改性，提高其乳化性、起泡性等功能特性已有較多研究成果,然而迄今為止，尚未見高濃度酶解技術(shù)對大豆蛋白進(jìn)行改性的研究報道。因此,本文擬利用酸性蛋白酶PR23對不同濃度的大豆分離蛋白進(jìn)行控制酶解，制備系列改性大豆蛋白,探討不同固形物濃度對大豆蛋白功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 山東香馳豆業(yè)科技有限公司,食品級;酸性蛋白酶PR23(活力為10萬U/g) 廣州裕立寶酶制劑有限公司,食品級;金龍魚調(diào)和油 市購;十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250 分析純;氫氧化鈉、鹽酸、硫酸鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等常用化學(xué)試劑 廣州市叢源儀器有限公司,分析純;牛血清蛋白、桿菌肽、抑酞酶、細(xì)胞色素C、谷胱甘肽 阿拉丁試劑公司,標(biāo)準(zhǔn)品。

Sartorius BP211D分析天平 德國賽多利斯儀器公司;600高效液相色譜儀 美國Waters公司;KDN-103F微量凱式定氮儀 廣州芊薈化玻儀器有限公司;KDN-40八孔消化爐 廣州市叢源儀器有限公司;Scientz-18N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;UV765紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 控制水解大豆分離蛋白制備不同水解度的改性大豆分離蛋白 參考張少敏等[11]的方法，將大豆分離蛋白按8∶92、16∶84、24∶76、32∶68 (w/w)溶于預(yù)先調(diào)好的醋酸緩沖液(pH3.0,0.05 mol/L),得到固形物濃度分別為8%、16%、24%、32%的大豆分離蛋白溶液,置于恒溫水浴鍋中振蕩預(yù)熱5 min,待溫度達(dá)到55 ℃和pH達(dá)到3.0,添加大豆分離蛋白重量1%的酸性蛋白酶(PR23),水浴振蕩,將振蕩速率控制在100～120 r/min,恒溫酶解。在6、12、18、24、30、36 h分別取樣,然后置于沸水浴中滅酶20 min,酶解液不離心,采用甲醛滴定法[12]測定水解得到的α-氨基氮含量,;凱氏定氮法[13]測定總氮。其余樣品進(jìn)行凍干(-40 ℃),得到改性大豆分離蛋白粉,密封于干燥器中備用。

水解度(DH,%)=(水解得到的α-氨基氮/樣品中總氮)×100

式(1)

1.2.2 改性大豆分離蛋白分子量分布測定 參考Xie等[9]的方法。高效液相色譜法測定分子量分布:洗脫液為含0.2 mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH6.8,濃度為0.05 mol/L),洗脫速度為1 mL/min。采用7.5×600 mm的分析柱(TSK-Gel)進(jìn)行分析。用0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10 mg/mL的蛋白溶液,過0.45 μm的醋酸纖維素膜,上樣20 μL進(jìn)行分析。

1.2.3 酶解產(chǎn)物氮溶解指數(shù)(NSI)測定 大豆分離蛋白粉(300 mg)溶解于30 mL去離子水中,用鹽酸溶液(1 mol/L)或氫氧化鈉溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH至4.0或7.0,常溫攪拌30 min后,8000 r/min離心20 min,得到上清液,分別測定上清液和原料的總氮含量。

氮溶解指數(shù)(NSI,%)=(上清液的蛋白含量/原料蛋白含量)×100

式(2)

1.2.4 分散穩(wěn)定性的測定 參考王章存等[14]的方法稍作修改,取適量的大豆分離蛋白粉溶解于蒸餾水中使其濃度為1.0 mg/mL,分別測定溶液初始的吸光度值(Amax)和10 min后的吸光度值(Amin)。

分散穩(wěn)定性(%)=Amin/Amax×100

式(3)

1.2.5 持水力(WHC)的測定 持水性為每克大豆蛋白酶解產(chǎn)物結(jié)合的去離子水的質(zhì)量(g),參照Tang等[15]的方法。準(zhǔn)確稱取蛋白大豆分離蛋白樣品200 mg(記為m)于10 mL的離心管中,記總重為W1,加入4 mL去離子水,漩渦震蕩至無明顯顆粒,室溫靜置30 min,3000 r/min離心20 min,倒掉上清液,稱量離心管質(zhì)量記為W2。

WHC(g/g)=(W2-W1)/m

式(4)

1.2.6 乳化性的測定 乳化性測定方法參照Pearce等[16]的方法并做適當(dāng)?shù)男薷?。配? mL的濃度為1%的大豆分離蛋白溶液,靜置30 min之后倒入玉米油(3 mL),高速剪切2 min(10000 r/min)制成乳化液。吸取50 μL乳液加入SDS溶液中(5 mL,濃度為0.1%)混合均勻。500 nm下測定吸光度值(以SDS溶液為空白)。

EAI(m2/g)=2×2.303×A500/φ×L×C×N×10-4

式(5)

式中：EAI是每克蛋白質(zhì)的乳化面積(m2/g);φ:體系中油相所占的體積分?jǐn)?shù)(本實驗中為0.25) N:稀釋倍數(shù)(本實驗中為100);C:蛋白濃度(g/mL);L:比色池光徑(1 cm)。

1.2.7 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定 參照MartaCorzo-Martínez[17]的實驗方法進(jìn)行測定。制備1%濃度的大豆分離蛋白溶液30 mL于100 mL的燒杯中,使用高速分散機(jī)以12000 r/min均質(zhì)1 min,迅速倒入100 mL的量筒中,記錄頁面高度(V0),靜置30 min后觀測液面高度(V30)。

起泡能力(%)=V0-30/30×100

式(6)

泡沫穩(wěn)定性(%)=(V30-30)/(V0-30)×100

式(7)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有測定數(shù)據(jù)重復(fù)三次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,使用 SPSS 16和EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固形物濃度對改性大豆分離蛋白分子量分布的影響

蛋白質(zhì)酶解是一個動態(tài)的過程,分子量的分布不僅能夠?qū)υ撨^程進(jìn)行有效的監(jiān)控,而且能夠表征蛋白酶的酶解特性以及蛋白質(zhì)酶解的難易程度。本實驗以酸性蛋白酶對不同固形物濃度的蛋白進(jìn)行酶解,分子量分布的結(jié)果見圖1。

圖1A為不同水解度下,不同固形物濃度(8%、32%)蛋白經(jīng)酸性蛋白酶控制酶解制備的改性大豆分離蛋白分子量分布圖。從圖1A可以得出:在底物濃度相同的情況下,隨著水解度的增大,改性大豆分離蛋白中大分子肽段的含量逐漸減少,小分子肽段的含量逐漸增多。在固形物濃度為8%時,當(dāng)水解度從6.4%增大為10.79%時,水解產(chǎn)物中分子量小于10 kDa的肽段含量從58.62%增長為67.29%,增加了14.79%。在固形物濃度為32%時,當(dāng)水解度從7.02%增大為10.36%時,改性大豆分離蛋白中分子量小于10 kDa的肽段含量從43.53%增長為58.91%。另外,固形物濃度為8%時,大于200 kDa的分子量隨著水解度的增加而明顯降低,而固形物濃度為32%時,該肽段的變化不是很明顯。

圖1B為水解度接近的條件下,不同固形物濃度對改性大豆分離蛋白分子量分布的影響。由圖1B可知,在水解度相同的條件下,隨著固形物濃度的增加,改性大豆分離蛋白中分子量小于10 kDa的肽段含量逐漸下降,而分子量在10～130、130～200 kDa以及大于200 kDa的肽段含量逐漸增加。這可能是因為在高濃條件下體系粘度大，物質(zhì)交換受到阻礙,限制了大分子物質(zhì)的降解[18]。

圖1 固形物濃度對改性大豆分離蛋白分子量分布的影響Fig.1 Influence of the solid concentration on the molecular weight distribution of the SPI hydrolyzate by PR23

2.2 固形物濃度對改性大豆分離蛋白氮溶解指數(shù)的影響

氮溶解指數(shù)(nitrogen solubility index,NSI)是一項衡量食物蛋白質(zhì)功能特性的指標(biāo),指的是該蛋白質(zhì)中能溶解于水的蛋白質(zhì)氮量占該蛋白質(zhì)氮總量的百分比。由圖2A、圖2B可知,在酸性條件下和中性條件下,酸性蛋白酶制備的改性大豆分離蛋白的氮溶解指數(shù)與水解度呈正相關(guān),且隨固形物濃度的增加而下降。與原料相比,經(jīng)過酶法改性后,改性大豆分離蛋白的氮溶解指數(shù)均顯著增加(p<0.05)。在同一固形物濃度條件下,隨著水解度的提升,氮溶解指數(shù)顯著增加(p<0.05)。在中性條件下,酶解濃度為 8%時,產(chǎn)物在中性條件下溶解度由原來的40.7%增加到64.17%(DH 6.31%)和74.97%(DH 10.79%),分別提高58%和84%;固形物濃度32%時,溶解度分別增加到54.33%(DH 7.02%)和65%(DH 10.36%),提高33.83%和60.11%。而產(chǎn)物在酸性條件下溶解度變化更為明顯,濃度8%,溶解度由原來的27%增加到62.42%(DH 6.31%)和71.74%(DH 10.79%),分別提高了1.31和1.65倍;固形物濃度32%時,溶解度分別增加到42.7%(DH 7.02%)和53.39%(DH 10.36%),提高了58.16%和97.77%。這是因為溶解性與蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、分子鏈長短、分子表面親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的比例和分布密切相關(guān)。大豆分離蛋白酶解后,斷裂成多肽和小分子短鏈物質(zhì),使-NH2和-COOH的數(shù)目增多,極性增加,電荷密度增大,親水性增強,從而提高了溶解性,表現(xiàn)為 NSI 值的增高[19]。另外在水解度接近的情況下,隨著固形物濃度的增加,氮溶解指數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢,并且酸性條件下比中性條件下降低程度顯著(p<0.05)。酸性條件下,在水解度為8.5%左右時,8%、16%、24%和32%的固形物濃度下,氮溶解指數(shù)分別達(dá)到70.2%、64.3%、61.3%和47.5%。而中性條件下,氮溶解指數(shù)分別達(dá)到72.7%、68.3%、61.8%和58.4%。這可能是因為,固形物濃度越高,酶解環(huán)境越擁擠,酶解效果受到影響,從而影響溶解度。

圖2 固形物濃度對酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物氮溶解指數(shù)的影響Fig.2 Influence of the solid concentration on the NSI of the SPI hydrolyzate by PR23注:A:pH7.0;B:pH4.0。

2.3 固形物濃度對改性大豆分離蛋白分散穩(wěn)定性的影響

實踐研究表明,一種大豆分離蛋白難于同時兼具高分散性、高溶解性、高乳化性、高起泡性等功能特性,需要針對不同的產(chǎn)品需求進(jìn)行相應(yīng)的功能改性[20]。由于大豆蛋白越來越多地應(yīng)用于肉脯、火腿腸等凝膠型食品和蛋白飲料等液體型食品的開發(fā)中,因此需要不斷地提高其分散性。蛋白質(zhì)的分散性是指蛋白質(zhì)在水中的快速分散能力,圖3A、圖3B為改性大豆分離蛋白在pH7.0和pH4.0條件下的分散穩(wěn)定性圖。在同一固形物濃度下,與原料相比,隨著水解度的增大,改性大豆分離蛋白在中性和酸性環(huán)境下分散穩(wěn)定性均增大。這主要是因為酶解越深,蛋白分子越小,在水中分散性越好,易溶于水而不至于沉淀。其中,在酸性條件下隨水解度增大,改性大豆分離蛋白分散穩(wěn)定性增加最為明顯。中性條件下,24%濃度下制備得到的改性大豆分離蛋白,其分散穩(wěn)定性為91.88%(DH10.87%)為原料的1.7倍,而酸性條件下,高濃度體系下的分散穩(wěn)定性反而低于低濃體系,該結(jié)果與溶解度類似。此外,無論是在中性還是酸性條件,改性大豆分離蛋白的分散穩(wěn)定性均不受酶解固形物濃度的影響。

圖3 固形物濃度對酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物分散穩(wěn)定性的影響Fig.3 Influence of the solid concentration on the dispersion stability of the SPI hydrolyzate by PR23注:A、B-改性大豆分離蛋白在中性、pH4.0條件的分散穩(wěn)定性,圖中標(biāo)注的數(shù)字為水解度。

2.4 固形物濃度對改性大豆分離蛋白持水力的影響

目前,粉狀大豆分離蛋白大量用于肉制品中,主要利用其保留水的能力,達(dá)到改善產(chǎn)品質(zhì)量、提高產(chǎn)品得率的目的。因此,大豆分離蛋白的持水性就顯得尤為重要[21]。由圖4所示,大豆分離蛋白原料的持水性最高,而改性大豆分離蛋白的持水力均低于原料蛋白。原料蛋白持水力為4.26 g/g;改性大豆分離蛋白(固形物濃度32%,DH 7.02%)的持水力為2.76 g/g。此外隨著水解度的增大,產(chǎn)物持水力呈現(xiàn)下降的趨勢,這主要是因為大豆分離蛋白在復(fù)水時形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),而經(jīng)過酶解作用后,小分子肽增多,不利于形成蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而使持水力下降[22]。此外,隨著水解度的增大,改性大豆分離蛋白的持水力呈下降趨勢,而在相同水解度下,隨著酶解固形物濃度的提高,改性大豆分離蛋白的持水力呈上升趨勢。其原因是高濃度條件下,酶解產(chǎn)物中大分子量的蛋白質(zhì)和多肽含量更多。

圖4 固形物濃度對酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物持水力的影響Fig.4 Influence of the solid concentration on the water binding capacity of the SPI hydrolyzate by PR23注:圖中標(biāo)注的數(shù)字為水解度。

2.5 固形物濃度對改性大豆分離蛋白乳化性的影響

表面活性是大豆分離蛋白最基本的性質(zhì)之一,而乳化性是其非常重要的表現(xiàn)形式,乳化特性是大豆分離蛋白運用于食品工業(yè)的一種重要的功能性質(zhì),包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性。乳化活性是指蛋白質(zhì)在促進(jìn)油水混合時,單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)(g)能夠穩(wěn)定的油水界面的面積(m2)。蛋白質(zhì)可以吸附在油水界面,降低界面張力,在油水混合時起到乳化的作用,形成多分散體系,這主要是由蛋白質(zhì)分子鏈內(nèi)部分布的親水或疏水基團(tuán)所決定的。

由圖5可知,改性大豆分離蛋白的乳化活性低于原料蛋白,且水解度越大，乳化活性越低。這是因為隨著水解度的提高,大分子蛋白降解為小分子多肽,親水性基團(tuán)大量暴露而疏水性基團(tuán)被破壞,使得油滴表面的保護(hù)層變薄,產(chǎn)物乳化性降低[23]。在水解度相似的條件下,隨著酶解固形物濃度的增加,改性大豆分離蛋白的乳化活性隨之增加。這是因為高濃環(huán)境限制了大分子蛋白分解為小分子肽,因而其產(chǎn)物乳化活性高于低濃環(huán)境下的酶解產(chǎn)物。

圖5 固形物濃度對酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物乳化活性的影響Fig.5 Influence of the solid concentration on the emulsifying ability of the SPI hydrolyzate by PR23注:該實驗使用的大豆分離蛋白為商用蛋白,制備時經(jīng)過一定的水解,測定其水解度在5%左右。

2.6 固形物濃度對酶解產(chǎn)物起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

固形物濃度對改性大豆分離蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響如圖6所示。由圖6A可知,原料大豆分離蛋白的起泡能力較差,而改性大豆分離蛋白的起泡性有所提高。在水解度相似的條件下,起泡能力隨著酶解固形物濃度的增大，呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢,當(dāng)水解度小于8%時,低濃度酶解產(chǎn)物起泡性高于高濃度,而水解度超過8%時,高濃度酶解產(chǎn)物起泡性高于低濃酶解產(chǎn)物。可能的原因是,低水解度下,低濃度酶解產(chǎn)物氮溶解指數(shù)較高,分子量小于高濃,蛋白質(zhì)分子大小合適,當(dāng)水解度進(jìn)一步增大時,低濃度條件下蛋白分子過小，而高濃度條件下由于酶解受到限制，獲得合適大小的蛋白質(zhì)分子而具有較高起泡性。并且在同一固形物濃度下,隨著水解度的提高,起泡性呈先升高后降低的趨勢。而最佳水解度的差異可能與原料的不同及水解度測定方法差異有關(guān)。酶解初期起泡性升高主要是因為液膜的形成是蛋白質(zhì)肽鏈相互作用的結(jié)果,蛋白分子在酶的作用下肽鏈展開,氮溶解指數(shù)提高,更多的肽參與到液膜的形成,從而使得起泡性增強。而隨著水解度的進(jìn)一步提高,形成的肽鏈越小,不足以穩(wěn)定液膜,泡沫易破裂,起泡性隨之降低。此外,起泡性的高低與可溶性蛋白的含量、分子量、結(jié)構(gòu)等密切相關(guān),是多種影響因素共同作用的結(jié)果。

圖6 固形物濃度對酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.6 Influence of the solid concentration on the foaming capactiy of the SPI hydrolyzate by PR23

通過圖6B可知,酶解處理降低了大豆分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性。在水解度相似的條件下,泡沫穩(wěn)定性與固形物濃度之間沒有明顯聯(lián)系,但是高濃度條件下酶解產(chǎn)物泡沫穩(wěn)定性高于低濃度,其原因可能是酶解使得產(chǎn)物中小分子肽段增多,疏水基團(tuán)暴露導(dǎo)致液膜變得脆弱,且小分子肽段的形成增加了蛋白分子電荷量,靜電作用阻礙蛋白質(zhì)分子的吸附作用,從而使得泡沫穩(wěn)定性下降。

3 結(jié)論

本文利用酸性蛋白酶酶解不同固形物濃度的大豆分離蛋白,并對酶解產(chǎn)物的功能特性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明，大豆分離蛋白經(jīng)過酸性蛋白酶控制酶解制備的改性大豆分離蛋白,其產(chǎn)物氮溶解指數(shù)、分散穩(wěn)定性、起泡性均提高,而持水力、乳化性、起泡穩(wěn)定性降低。在相同水解度下,隨著固形物濃度的提高,改性大豆分離蛋白的分散穩(wěn)定性、持水力和乳化性均呈上升趨勢。當(dāng)水解度小于8%時,低濃度酶解產(chǎn)物起泡性高于高濃度,而水解度超過8%時,高濃度酶解產(chǎn)物起泡性大體高于低濃度酶解產(chǎn)物,而就起泡穩(wěn)定性而言前者也高于后者,說明高濃度和常濃度狀態(tài)酶解模式存在差異性。酸性蛋白酶催化制備的改性大豆分離蛋白的分散穩(wěn)定性與酶解固形物濃度無明顯關(guān)系。