董 銘,白 云,李月秋,王 鵬,韓敏義,*,孫京新,徐幸蓮,周光宏

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部肉品加工重點(diǎn)實(shí)驗室,江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,肉品加工與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,江蘇南京 210095;2.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗中心,河北保定 071000;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

自從20世紀(jì)60年代報道了電場對微生物作用后,研究人員將就它應(yīng)用于食品工業(yè)的各個領(lǐng)域,其中也包括了脈沖電場對食品蛋白質(zhì)的改性方面[1]。脈沖電場(pulsed electric field,PEF)技術(shù)主要是通過將脈沖電場(0.1～80 kV·cm-1)作用到放置于2個電極之間的食品物料上,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對食品的非熱加工處理。脈沖電場處理可以改變食品材料結(jié)構(gòu)而不會產(chǎn)生其他副作用(如嚴(yán)重結(jié)構(gòu)改變、有害微生物污染、變色和變味等),與傳統(tǒng)熱加工相比,它可以最大限度地保持食品品質(zhì),如風(fēng)味和營養(yǎng)價值[2-3],這是研究人員對此技術(shù)青睞的主要原因。脈沖電場加工處理大多在室溫或者低于室溫下操作,它能連續(xù)操作,通過對兩電極間的食品物料施加往復(fù)高電壓短脈沖的形式進(jìn)行,由于加熱導(dǎo)致的能量損失非常小。脈沖電場加工處理的作用效果與施加的電場強(qiáng)度、脈沖波形、處理時間(脈沖個數(shù)×脈沖寬度)、脈沖頻率、處理溫度及被處理食品物料屬性(種類、酸堿度、離子強(qiáng)度、幾何尺寸等)等因素有關(guān),其中電場強(qiáng)度和處理時間最關(guān)健[4-5]。對食品品質(zhì)特性來說,脈沖電場處理技術(shù)很大程度上降低了食品感官和理化特性的不利變化,從而優(yōu)于傳統(tǒng)的食品熱加工處理技術(shù),研究顯示PEF能替代熱加工處理技術(shù)或與熱加工處理技術(shù)聯(lián)用,因此成為食品加工業(yè)極具應(yīng)用潛力的技術(shù),近年來引起了國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注[6-7]。

蛋白質(zhì)作為食品中的主要營養(yǎng)成份之一,其功能性質(zhì)對食品品質(zhì)起到至關(guān)重要的作用[8-9]。與其他蛋白質(zhì)改性方法比較,物理改性方法擁有處理時間短、能耗低、安全可靠、對產(chǎn)品營養(yǎng)性質(zhì)影響小、終產(chǎn)品品質(zhì)高等顯著優(yōu)點(diǎn)[10]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解于水溶劑中時,分子中的帶電氨基酸殘基與極性基團(tuán)使蛋白質(zhì)分子也帶電荷,從而為脈沖電場誘使蛋白質(zhì)改性提供了理論依據(jù)。脈沖電場處理促進(jìn)分子有序排列,能為蛋白質(zhì)氨基、巰基和羧基等殘基之間的化學(xué)反應(yīng)提供反應(yīng)所需能量,從而達(dá)到改變蛋白質(zhì)性質(zhì),更有利于蛋白質(zhì)的聚集,最終誘導(dǎo)改變蛋白質(zhì)功能性質(zhì)[11-12]。然而,PEF處理技術(shù)在以蛋白質(zhì)為主要成分的食品物料中尚有很大潛力,然而PEF對蛋白質(zhì)的作用機(jī)理還沒有被完全闡述清楚,需要更多更深入探索研究。本文綜述了脈沖電場處理對食品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響,以期為今后從事該領(lǐng)域方向的科技工作者提供幫助與參考。

1 脈沖電場技術(shù)處理對食品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

脈沖電場技術(shù)處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)改性是當(dāng)今蛋白質(zhì)改性研究的熱點(diǎn),其改性的主要機(jī)理是蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)吸收電場能量產(chǎn)生自由基或聚集,導(dǎo)致蛋白質(zhì)解折疊。產(chǎn)生的自由基會破壞蛋白質(zhì)分子之間相互作用(如范德華力、靜電和疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵和離子鍵等),從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的改變[13],脈沖電場技術(shù)在食品蛋白質(zhì)物理改性方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力,在脈沖電場影響下,水分子配位能力顯著增大;而且,當(dāng)PEF作用到蛋白質(zhì)時,處于蛋白質(zhì)表面的離子就會受到電場的作用力影響,作用力大小和方向都隨時間變化而發(fā)生變化,從而對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能特性產(chǎn)生影響[14]。在食品加工中就要充分利用這些影響。同時,施加外部高強(qiáng)電場環(huán)境會改變蛋白質(zhì)所在的局部靜電場,從而誘導(dǎo)肽鏈的靜電相互作用被破壞[15]。蛋白質(zhì)分子在電場影響下折疊會解開,之后會發(fā)生相互作用,最終形成蛋白質(zhì)分子聚集。而且,蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈具有極強(qiáng)的偶極矩,從而受電場、局部靜電場作用的影響;蛋白質(zhì)中多肽鏈在靜電相互作用下遭到外加電場破壞。也有理論認(rèn)為,蛋白質(zhì)分子聚集形成過程如下:解折疊后的蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)會變得疏松,通過非共鍵連接的蛋白質(zhì)分子二聚體及多聚體會發(fā)生解離,從而使更多的疏水基團(tuán)暴露。這些部分解折疊蛋白會通過較弱的非共價鍵(如疏水相互作用)和共價鍵(如二硫鍵)形成蛋白質(zhì)聚集[16],脈沖電場技術(shù)處理對蛋白質(zhì)的這些影響作用可以通過疏水性、巰基和二硫鍵、二級結(jié)構(gòu)和和三級結(jié)構(gòu)等反映出來。

1.1 疏水性

蛋白質(zhì)表面疏水性是表征蛋白質(zhì)表面和接觸極性溶液環(huán)境疏水基團(tuán)的重要參數(shù),也是維系蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力,與蛋白質(zhì)的最終功能性質(zhì)有很大的相關(guān)性,對于研究蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)具有十分重要的意義。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中,非極性的氨基酸側(cè)鏈一般包埋于蛋白分子內(nèi)部,從而使蛋白質(zhì)出現(xiàn)疏水性內(nèi)核,而極性氨基酸則會分布于蛋白質(zhì)分子的表面區(qū)域而出現(xiàn)親水屬性,但在蛋白質(zhì)分子表面也會有一些疏水基團(tuán)存在,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面呈現(xiàn)出一定程度的疏水性。在外部電場作用下的蛋白質(zhì)分子微小構(gòu)象上的改變便會誘使以前隱藏在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性的改變[17]。

Xiang等[18]采用電場強(qiáng)度分別為22、25 kV·cm-1,脈沖個數(shù)分別為30、60、90、120的脈沖電場處理大豆分離蛋白(SPI),結(jié)果顯示脈沖電場技術(shù)會改變SPI的結(jié)構(gòu)而使其表面疏水性增加。脈沖電場技術(shù)處理對菜籽蛋白的結(jié)果表明,脈沖電場電壓、脈沖頻率及物料處理時間會影響其表面疏水性。電壓和物料處理時間會顯著增加菜籽蛋白表面疏水性,電壓低于35 kV時疏水性隨電壓增加而提高。物料處理時間低于150 s時,蛋白表面疏水性隨著時間延長而提高,150 s時達(dá)到最高。在脈沖頻率為400 Hz時菜籽蛋白的疏水性達(dá)到最高值,400 Hz后會降低。在脈沖寬度為6 μs時其疏水性達(dá)到最高值,之后有所降低[19]。脈沖電場技術(shù)處理對大豆分離蛋白(SPI)的疏水性也有類似影響,疏水性會隨著電場強(qiáng)度的提高和處理時間的延長而增加,在脈沖電場強(qiáng)度和處理時間分別高于30 kV·cm-1和288 μs時會降低[20]。

Perez等在使用脈沖電場技術(shù)處理β-乳球蛋白和卵白蛋白的研究中發(fā)現(xiàn),脈沖電場導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生了極化,致使疏水性氨基酸或巰基暴露,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,當(dāng)輸入脈沖能量足夠高時,在疏水相互作用和共價鍵的影響下形成蛋白質(zhì)分子聚集[17]。國內(nèi)研究人員也得出了相類似的結(jié)果,β-乳球蛋白分子表面疏水性和空白對照相比有不同程度的提高,而且隨處理時間的增加呈現(xiàn)出先提高后下降的趨勢。當(dāng)處理時間達(dá)30 μs時,蛋白質(zhì)表面疏水性達(dá)到最高值,其原因主要是PEF處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開,使蛋白質(zhì)疏水性提高。當(dāng)PEF繼續(xù)作用于β-乳球蛋白溶液時,蛋白質(zhì)分子的表面疏水性開始降低,原因可能是由于PEF的電擊作用改變了蛋白質(zhì)分子電荷分布,從而使β-乳球蛋白分子內(nèi)部基團(tuán)距離變小,蛋白質(zhì)部分折疊,疏水基團(tuán)則會重新包埋到蛋白質(zhì)分子內(nèi)部,最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面疏水性降低[21]。國內(nèi)的曾新安團(tuán)隊、楊瑞金團(tuán)隊及殷涌光團(tuán)隊?wèi)?yīng)用脈沖電場技術(shù)做了很多相關(guān)工作。他們探究了脈沖電場技術(shù)處理對蛋清蛋白表面疏水性作用效果,結(jié)果也顯示隨PEF處理時間的增加蛋清蛋白分子的表面疏水性表現(xiàn)出先提高,然后有所下降的趨勢[22]。脈沖電場技術(shù)使得乳清蛋白蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水相互作用發(fā)生改變,其主要原因是脈沖電場處理使乳清蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,暴露了更多的疏水性區(qū)域,最終表現(xiàn)為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性提高[23]。

在肌肉蛋白中的應(yīng)用效果顯示,脈沖電場技術(shù)處理的肌原纖維蛋白(MP)的相對熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。隨電場強(qiáng)度的提高,相對熒光強(qiáng)度也開始增加。在脈沖電場強(qiáng)度達(dá)到35 kV·cm-1時,相對熒光強(qiáng)度也達(dá)到最高值,顯示脈沖電場處理使MP分子內(nèi)部疏水相互作用改變,主要原因是脈沖電場肌原纖維蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致暴露出更多的疏水區(qū)域,最終表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的表面疏水性提高。然而當(dāng)脈沖電場電場強(qiáng)度提高到40 kV·cm-1時,相對熒光強(qiáng)度開始降低,主要原因是由于極化了的MP分子之間相互作用加強(qiáng),導(dǎo)致蛋白分子聚集體重新形成[24]。從以上可以看出,大部分研究都顯示,疏水性都表現(xiàn)出先增加而后降低的趨勢,因此要充分利用這個特點(diǎn),選擇合適的脈沖電場作用參數(shù),根據(jù)最終的應(yīng)用目的加以利用。

1.2 巰基和二硫鍵

大部分蛋白質(zhì)都含有二硫鍵(-SS-)和巰基(-SH),并且二硫鍵和自由巰基對蛋白質(zhì)的功能特性包括凝膠特性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性有著十分重要的影響。蛋白質(zhì)分子中巰基是生成二硫鍵的前體,而二硫鍵是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力,一般巰基氧化會形成二硫鍵,從而對產(chǎn)品的最終品質(zhì)造成影響。脈沖電場技術(shù)處理會使蛋白質(zhì)分子展開,暴露了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部基團(tuán)。報道顯示含有自由巰基的分子在經(jīng)過PEF處理后會發(fā)生化學(xué)變化[16]。

在PEF影響下,巰基發(fā)生變化,從而使多肽鏈構(gòu)象發(fā)生變化。多數(shù)研究結(jié)果顯示,PEF處理會使巰基變得更加活潑,同時表面巰基含量也會隨著脈沖場強(qiáng)與處理時間的增加而提高[20-25],然而繼續(xù)延長處理時間巰基的含量又會降低。研究結(jié)果表明,PEF處理使菜籽蛋白的自由巰基含量明顯提高,在脈沖電壓為35 kV時自由巰基含量是空白組的2倍,表明PEF誘導(dǎo)菜籽蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)局部展開,二硫鍵發(fā)生斷裂,使形成的巰基暴露在分子表面;不過,隨著脈沖電場強(qiáng)度增加或物料處理時間延長,蛋白質(zhì)總巰基含量卻明顯下降[19],可能是PEF對兩種巰基的作用不同,使總巰基發(fā)生氧化,形成二硫鍵。大豆分離蛋白(SPI)表面自由巰基隨著脈沖電場強(qiáng)度的增加與處理時間的延長而提高,然而當(dāng)脈沖電場強(qiáng)度與處理時間分別高于30 kV·cm-1和288 μs時則會降低[20]。改變主要是由于脈沖電場處理導(dǎo)致暴露了蛋白分子內(nèi)部疏水基團(tuán),改變蛋白質(zhì)表面疏水性,誘使活性基團(tuán)間相互反應(yīng),巰基與二硫鍵受到影響,最后致使大豆分離蛋白發(fā)生聚集,而過高的PEF又會導(dǎo)致疏水基團(tuán)間相互作用,致使他們又重新隱藏起來[11]。Dolores等用PEF對蛋清溶液和卵白蛋白溶液處理后的結(jié)果顯示,PEF處理增加了與5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)可反應(yīng)的自由巰基量,原因可能是蛋白質(zhì)分子形成了部分解折疊或增強(qiáng)了巰基離子化程度,然而蛋白質(zhì)的凝膠性質(zhì)并沒有相應(yīng)發(fā)生明顯改變[25]。PEF對牛血清白蛋白和卵白蛋白處理的研究結(jié)果顯示,PEF電場強(qiáng)度從25提高到35 kV·cm-1時暴露巰基明顯增加而總巰基降低[16]。因此,對于特定的食品蛋白質(zhì),需要確定合適的脈沖電場處理參數(shù)來達(dá)到應(yīng)用的目的。

1.3 二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲[26]。研究顯示,脈沖電場處理對食品蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有顯著影響,蛋白質(zhì)α-螺旋下降,β-折疊含量上升對蛋白質(zhì)后期的功能性質(zhì)改善有利。

Qian等[27]研究發(fā)現(xiàn)PEF能改變固體卵清蛋白的二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致二硫鍵斷裂、氫鍵被破壞,使α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊,α-螺旋下降,β-折疊含量上升,但是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)沒有變化。PEF也使菜籽蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,菜籽蛋白肽鏈解旋,由有序向無序狀態(tài)改變。經(jīng)過不同脈沖電壓處理后,蛋白質(zhì)酰胺I帶各譜峰百分比含量發(fā)生改變,α-螺旋及β-折疊含量都有所下降,無規(guī)則卷曲含量明顯提高,β-轉(zhuǎn)角含量無明顯改變,然而峰值大小幾乎無變化[19]。李迎秋[28]通過對PEF處理作用下大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)研究顯示,PEF處理誘導(dǎo)了蛋白分子的極化,破壞了維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的氫鍵等作用力,使大豆分離蛋白分子部分伸展,基團(tuán)暴露,從而使二級結(jié)構(gòu)含量增加;較強(qiáng)的脈沖條件使極化的蛋白分子之間相互吸引重新形成分子聚集體,使其伸展的結(jié)構(gòu)又發(fā)生折疊。進(jìn)一步拉曼分析結(jié)果顯示蛋白質(zhì)α-螺旋含量下降、β-折疊和無規(guī)則卷曲含量提高[11],同時β-折疊隨處理時間的增加,呈現(xiàn)先提高后下降的趨勢,表明大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)被破壞[20]。Liu等也發(fā)現(xiàn),35 kV·cm-1PEF使大豆分離蛋白的反平行β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊等二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化[29]。脈沖電場處理后玉米醇溶蛋白的酰胺I帶拉曼光譜特征峰相對強(qiáng)度提高,表明處理后的β-折疊結(jié)構(gòu)百分比含量提高。在酰胺III帶的拉曼光譜特征峰波數(shù)向左偏移,而且相對強(qiáng)度也有所提高,表明β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量提高,α-螺旋解開,C=O雙鍵的斷裂促使羥基基團(tuán)含量提高[30-31]。PEF處理后β-乳球蛋白分子的α-螺旋與β-折疊隨PEF處理時間增加出現(xiàn)先提高而后降低趨勢,與此相反,β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲則先下降后提高,原因是短時脈沖電場處理,破壞了維系蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的次級鍵(包括氫鍵、范德華力和靜電相互作用等),致使結(jié)構(gòu)展開,于是β-折疊含量提高。進(jìn)一步延長處理時間,蛋白分子發(fā)生極化,蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)的定位和氨基酸殘基間的電場分布破壞,破壞了β-乳球蛋白的二級結(jié)構(gòu),從而β-折疊含量下降,無規(guī)則卷曲提高,之前展開的蛋白結(jié)構(gòu)又變得致密[21]。PEF對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響不同研究有所差異,大部分研究認(rèn)為PEF會破壞蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu),但由于所研究蛋白質(zhì)不同,PEF作用的參數(shù)也有差異,導(dǎo)致最終的結(jié)果與不盡相同。

1.4 三級結(jié)構(gòu)

內(nèi)源熒光變化是表征蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的常用指標(biāo)。內(nèi)源熒光主要源于蛋白質(zhì)中的色氨酸殘基(Trp),這種氨基酸殘基對微環(huán)境的變化十分敏感,因此一般用Trp殘基來作為內(nèi)源熒光探針來表征蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化情況。

PEF處理提高了β-乳球蛋白的熒光強(qiáng)度,而且出現(xiàn)先增加后下降的變化,在25 kV·cm-130 μs時熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值。作者分析原因可能是PEF處理的電場影響導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水及靜電相互作用、氫鍵等發(fā)生改變,致密的立體構(gòu)象松散,β-乳球蛋白分子的2個Trp殘基被暴露在極性環(huán)境,熒光強(qiáng)度提高,處理時間30 μs時達(dá)到最高。繼續(xù)延長處理時間,熒光強(qiáng)度有降低的趨勢,原因是蛋白質(zhì)分子又通過非共價鍵作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分折疊,原來暴露于蛋白質(zhì)表面的Trp殘基又掩埋到了分子內(nèi)部[21]。脈沖電場作用后,固體卵清蛋白自由巰基增加,總巰基降低,表明脈沖電場會作用于蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu),導(dǎo)致某些空間結(jié)構(gòu)展開,暴露原來隱藏的巰基結(jié)構(gòu)[27]。

脈沖電場處理對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)影響與食品蛋白質(zhì)的種類緊密相關(guān),還有研究結(jié)果顯示脈沖電場處理在某些條件下對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)沒有影響,產(chǎn)生這些矛盾的原因除了蛋白質(zhì)本身的原因之外與脈沖電場的作用參數(shù)及處理時間有很大的關(guān)系。Singh等[32]從分子水平上研究了外加電場對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用,通過脈沖電場誘導(dǎo)微環(huán)境中大豆蛋白的色氨酸殘基,發(fā)現(xiàn)其變化帶來的極性是部分變性蛋白質(zhì)引起的。同時發(fā)現(xiàn)低場強(qiáng)對蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)幾乎沒有作用,高場強(qiáng)則導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變從而導(dǎo)致和溶劑接觸面積變大。高強(qiáng)度脈沖電場使蛋白質(zhì)肽鏈間靜電相互作用遭到破壞,從而可能會誘使蛋白質(zhì)分子發(fā)生宏觀結(jié)構(gòu)改變,如暴露了某些內(nèi)部結(jié)構(gòu),加劇了蛋白質(zhì)間相互作用。

2 脈沖電場技術(shù)對食品蛋白質(zhì)功能特性的影響

蛋白質(zhì)的功能特性在很大程度上由其結(jié)構(gòu)決定。脈沖電場處理改變了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu),必然會使蛋白質(zhì)功能特性改善或下降,從而最終影響食品的質(zhì)構(gòu)和功能特性。

2.1 溶解度

溶解度是蛋白質(zhì)十分重要的理化性質(zhì),它靠蛋白質(zhì)與水分子間相互作用維系。溶解度不僅對蛋白質(zhì)的分離、提取及純化有影響,對其他功能特性(如乳化性、起泡性、增稠性和凝膠性等)都有明顯影響。也是表征蛋白質(zhì)變性及聚集的一個指標(biāo)。一般而言,溶解度高的蛋白質(zhì)功能性質(zhì)好,而溶解度低的蛋白質(zhì)的功能特性和使用范圍是非常有限的。

脈沖電場對蛋白質(zhì)溶解度的作用和其作用的電場強(qiáng)度與處理時間有關(guān)。吳新用脈沖電場技術(shù)處理牛乳蛋白后發(fā)現(xiàn)其溶解性改善,在30 kV·cm-1達(dá)到最大值[33]。隨著電場強(qiáng)度與處理時間的增加,大豆分離蛋白的溶解度提高,當(dāng)電場強(qiáng)度(電壓)與處理時間分別高于30 kV·cm-1和288 μs時降低[20]。電壓低于30 kV時,菜籽蛋白質(zhì)溶解度明顯提高,加深了蛋白質(zhì)分子極化的程度,打破了維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的疏水和靜電相互作用、二硫鍵等非共價鍵作用力,蛋白質(zhì)分子局部展開,提高了溶解度。進(jìn)一步增加電壓和物料處理時間,充分暴露了隱藏在分子內(nèi)部的巰基和疏水基團(tuán),展開的蛋白質(zhì)分子間又形成新的蛋白質(zhì)分子聚集,降低了蛋白質(zhì)溶解度[19]。李迎秋等[34]使用0～40 kV·cm-1PEF處理大豆分離蛋白,也發(fā)現(xiàn)隨著脈沖電場強(qiáng)度(0～35 kV·cm-1)和處理時間(0～432 μs)提高大豆分離蛋白的溶解度得到改善。脈沖強(qiáng)度或處理時間高于35 kV·cm-1或432 μs時溶解度下降。而且較強(qiáng)的PEF也顯著改善了對菜籽蛋白的溶解度[19]。PEF也可以與超聲波、糖基化等其它手段一起使用,當(dāng)處理條件為脈沖電場強(qiáng)度15 kV·cm-1、超聲波處理時間36 min、超聲波功率300 W時,黑豆分離蛋白的溶解度明顯改善[14]。Sun Weiwei等[35]利用PEF結(jié)合糖基化處理乳清分離蛋白,發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度的PEF處理能夠加速糖基化反應(yīng),改善了乳清分離蛋白溶解度[36]。然而,吳新等[37]研究了脈沖電場處理對酪蛋白溶解度的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著脈沖強(qiáng)度增加和處理時間延長,酪蛋白溶解度降低。趙偉等[22]使用25～35 kV·cm-1100～800 μs PEF技術(shù)處理蛋清蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEF處理電場強(qiáng)度及處理時間過長會使蛋白質(zhì)分子間形成聚集,降低了蛋白質(zhì)溶解度。蛋白質(zhì)溶解度降低的原因可能是所用處理參數(shù)不當(dāng)引起的。

2.2 乳化特性

乳化特性是食品蛋白質(zhì)的另外一項重要功能特性,它與食品的保油性密切相關(guān)。多數(shù)研究結(jié)果證實(shí)適度的脈沖電場處理會改善蛋白質(zhì)的乳化特性,最終產(chǎn)品(尤其是肉制品)的保油性十分有吸引力。

趙偉等[22]采用25～35 kV·cm-1PEF處理蛋清蛋白100～800 μs后,發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白乳化特性有所提高。而繼續(xù)增加PEF處理電場強(qiáng)度和延長處理時間,蛋白質(zhì)分子之間會形成聚集,導(dǎo)致其乳化功能下降。李迎秋等[34]研究了脈沖電場對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的作用,結(jié)果顯示PEF會顯著提高β-乳球蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性。脈沖電壓為30 kV時,乳化能力最優(yōu)。脈沖電場強(qiáng)度高于30 kV·cm-1或處理時間大于144 μs時乳化性下降。其原因可能是PEF導(dǎo)致蛋白分子極化,從而破壞了維系蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的非共價作用力,而且局部伸展的蛋白質(zhì)分子提高了分子的柔性,油水界面結(jié)合了更多的蛋白質(zhì)分子,原來隱藏于蛋白分子內(nèi)部的疏水殘基暴露到表面,使蛋白質(zhì)的乳化性能提高[28]。進(jìn)一步提高電壓和處理時間,極化的蛋白質(zhì)分子之間會相互吸引,通過非共價鍵而形成更大蛋白質(zhì)分子聚集,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子柔性降低,最終,降低了蛋白質(zhì)乳化及乳化穩(wěn)定性[19]。糖基化處理結(jié)合不同電場強(qiáng)度PEF后,β-乳球蛋白的乳化穩(wěn)定性和乳化性都明顯改善[36]。Sun Weiwei等[35]也發(fā)現(xiàn)糖基化處理結(jié)合PEF改善了乳清分離蛋白的乳化特性。

2.3 凝膠特性

蛋白質(zhì)的凝膠特性(包括凝膠強(qiáng)度和凝膠微觀結(jié)構(gòu)等)與最終食品的質(zhì)構(gòu)關(guān)系密切[38]。

研究發(fā)現(xiàn)與空白組相比,較低的PEF電場強(qiáng)度會降低乳清蛋白凝膠硬度,隨著PEF電場強(qiáng)度的逐步增強(qiáng),硬度開始提高,PEF電場強(qiáng)度為35 kV·cm-1時,硬度達(dá)到最高值[23-24]。對于肌原纖維蛋白也有類似效果,在PEF電場強(qiáng)度小于35 kV·cm-1時,隨PEF電場強(qiáng)度的增強(qiáng)肌原纖維蛋白凝膠彈性增加,大于35 kV·cm-1時,隨PEF電場強(qiáng)度增強(qiáng)肌原纖維蛋白凝膠彈性下降,隨PEF脈沖個數(shù)的增多肌原纖維蛋白凝膠彈性提高,增加到脈沖數(shù)為4時,脈沖個數(shù)繼續(xù)增加,增幅會下降[24]。Rodrigues等發(fā)現(xiàn)用溫和PEF處理乳清分離蛋白后蛋白質(zhì)凝膠形成性、黏彈性和分散性發(fā)生變化[39]。同時,脈沖電場和超聲波也有相互促進(jìn)作用,超聲波處理時間為36 min、超聲波功率300 W、脈沖電場強(qiáng)度為15 kV·cm-1時,黑豆分離蛋白凝膠硬度得到改善,掃描電子顯微鏡(SEM)的結(jié)果也表明此時黑豆蛋白形成了更為均一、致密、規(guī)則和表面平整的凝膠[14]。

2.4 保水保油性

保水保油性作為食品蛋白質(zhì)凝膠最重要的功能特性之一,提高食品蛋白質(zhì)的保水性及保油性,一方面可以有效維持食品風(fēng)味,增強(qiáng)食品口感;同時可降低食品水分及脂肪的流失[19],從而增加產(chǎn)品的出品率,降低生產(chǎn)成本。在適當(dāng)條件下,食品蛋白質(zhì)形成的熱誘導(dǎo)凝膠可以保留大量水、脂肪及其他食品成分[40]。研究表明,PEF對食品蛋白質(zhì)保水保油性有顯著改善效果。

在PEF電場強(qiáng)度小于35 kV·cm-1時,隨著脈沖電場強(qiáng)度的增加凝膠保水性提高,但電場強(qiáng)度大于35 kV·cm-1后增幅改變不明顯[23]。當(dāng)處理條件為超聲波處理時間36 min、超聲波處理功率300 W、PEF電場強(qiáng)度15 kV·cm-1時,黑豆分離蛋白保水性提高[14]。然而,金聲瑯等[23]發(fā)現(xiàn),與對空白照組相比,15～25 kV·cm-1的PEF處理后乳清蛋白蛋白凝膠保水性下降。原因可能是PEF使蛋白分子極化,破壞了維系蛋白空間結(jié)構(gòu)的非共價鍵作用,凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定,導(dǎo)致蛋白凝膠保水性降低。PEF強(qiáng)度大于35 kV·cm-1時,凝膠保水性明顯提高,他們認(rèn)為原因可能是:第一,蛋白分子被PEF誘導(dǎo)極化,打破了二硫鍵和氫鍵,部分展開的蛋白分子和溶劑水相互作用加強(qiáng),從而形成了新的蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu);第二,水分子在脈沖電場作用下聚合,水分子之間的距離縮小,導(dǎo)致自由水填充到蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈周圍轉(zhuǎn)變成結(jié)合水,樣品保水性得到改善;第三,PEF通過電致伸縮作用導(dǎo)致二價陽離子和蛋白質(zhì)分子之間的鍵合作用破壞,使添加食鹽的乳清蛋白構(gòu)象改變,蛋白質(zhì)分子與陽離子間形成鹽橋的可能性下降,從而提高了蛋白質(zhì)凝膠保水性[23]。肌原纖維蛋白與此類似,與空白對照組相比,2～8個脈沖使肌原纖維蛋白凝膠保水性明顯改善,脈沖個數(shù)為4時,肌原纖維蛋白凝膠保水性最優(yōu),更為穩(wěn)定肌原纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成,繼續(xù)增加脈沖個數(shù)其保水性不會再提高[24]。王麗娟[19]發(fā)現(xiàn),脈沖電壓在25 kV時菜籽蛋白的保油性達(dá)到最高。脈沖電壓大于25 kV后又明顯下降?？赡苁怯捎诓俗训鞍椎膶EF耐受性比較低,PEF處理使菜籽蛋白變性,打開了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu),更多的親油基暴露出來,導(dǎo)致菜籽蛋白吸油性改善[19]。不同蛋白質(zhì)受PEF影響不同,因此針對不同食品原料需要優(yōu)化PEF處理的參數(shù),以達(dá)到理想的效果。

2.5 變性聚集

一般研究認(rèn)為,脈沖電場導(dǎo)致的溫度升高會造成蛋白質(zhì)變性和聚集[2]。但變性和聚集對蛋白質(zhì)的功能特性改善是否有利還需要進(jìn)一步研究。

PEF誘使牛血清蛋白中卵白蛋白和β-乳球蛋白通過二硫鍵形成蛋白質(zhì)聚集[16-17]。拉曼光譜結(jié)果也顯示溶菌酶的二硫鍵構(gòu)像發(fā)生顯著改變,表明PEF使蛋白質(zhì)通過巰基/二硫鍵間相互作用形成蛋白質(zhì)聚集[41]。PEF電場強(qiáng)度(電壓)和處理時間是主要的參數(shù),在PEF電壓20～35 kV時沒有發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白(BSA)聚集形成,可能是BSA中巰基含量較少,在中度PEF處理條件下一般可以保持穩(wěn)定,當(dāng)PEF強(qiáng)度大于25 kV時BSA和卵白蛋白混合蛋白會形成聚集[16]。對于大豆分離蛋白(SPI)和蛋清蛋白(egg white proteins)也是如此,增加PEF處理強(qiáng)度與延長處理時間,蛋白質(zhì)變性和聚集就會發(fā)生[20,42]。

2.6 其它蛋白質(zhì)功能特性

PEF電壓低于30 kV時,菜籽蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性都明顯改善,當(dāng)電壓為30 kV時,起泡性和泡沫穩(wěn)定性最優(yōu),原因是PEF導(dǎo)致菜籽蛋白局部伸展,使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性殘基暴露到表面,導(dǎo)致水和空氣界面的形成,蛋白質(zhì)分子之間通過非共價相互作用力生成了穩(wěn)定的界面膜和二維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而使起泡性和泡沫穩(wěn)定性改善。然而當(dāng)進(jìn)一步加大電壓和處理時間時,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基和疏水基團(tuán)充分暴露。蛋白質(zhì)分子極化生成新的蛋白質(zhì)分子聚集,降低了空氣和水形成的界面膜穩(wěn)定性,最終起泡性和泡沫穩(wěn)定性下降[19]。PEF處理改善了玉米醇溶蛋白膜特性,在PEF和乙醇共同影響下,有序排列的玉米醇溶蛋白分子形成均一的蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),薄膜均一性提高,形成的蛋白膜形狀完整、內(nèi)部結(jié)合更為緊密、表面平整光滑,PEF處理的玉米醇溶蛋白膜拉伸強(qiáng)度高于未經(jīng)PEF處理組[30]。田明等[36]用15 kV·cm-1的PEF處理90 μs與糖基化結(jié)合處理β-乳球蛋白,結(jié)果顯示β-乳球蛋白分子解折疊,自由氨基含量明顯下降,β-乳球蛋白過敏原性降低。同一研究團(tuán)隊的Yang WH等近期也得到類似結(jié)論,PEF與糖基化結(jié)合可以降低β-乳球蛋白過敏原性[43]。研究證實(shí),未PEF處理的蛋白質(zhì)溶液羰基值為零,而經(jīng)過25 kV·cm-1PEF處理800 μs后蛋白質(zhì)的羰基值沒有改變,表明蛋白質(zhì)氧化沒有發(fā)生[44]。Guan YG等研究證實(shí)PEF處理可以加速牛血清白蛋白(BSA)-葡聚糖溶液體系的糖基化反應(yīng)進(jìn)程[45]。另外,PEF對液全蛋起泡性[46]、豆奶流變特性[47]有顯著影響。綜上所述,多數(shù)研究結(jié)果都證實(shí),PEF對蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)都有改善作用,但作用的參數(shù)需要針對特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化。

3 結(jié)論和展望

脈沖電場技術(shù)(PEF)屬于典型的交叉學(xué)科,涉及到物理學(xué)、電子學(xué)、化學(xué)、微生物學(xué)和工程技術(shù)等多個學(xué)科,被譽(yù)為本世紀(jì)最具潛力的食品非熱加工處理高新技術(shù),它能應(yīng)用到非連續(xù)相的固體食品物料或連續(xù)相的液體食品,與電極不接觸或不同接觸,在原料運(yùn)輸與預(yù)處理過程中也可施加脈沖電場處理,從而對實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模處理十分有利[19]。PEF處理可以改變食品生物大分子與內(nèi)分子間的非共價作用,進(jìn)而影響食品生物大分子的結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)其功能特性發(fā)生改變,使食品的品質(zhì)特性得以改善。以PEF處理食品蛋白質(zhì),對蛋白質(zhì)進(jìn)行物理改性研究,其處理過程零污染,操作方便。PEF改變食品蛋白質(zhì)理化性質(zhì)處理操作時間短、能耗低而且加工過程中食品組分變化小,因此探索利用PEF技術(shù)來影響對食品中蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)與功能特性具有十分重要的意義。

當(dāng)前影響PEF在食品蛋白質(zhì)改性中應(yīng)用的主要瓶頸在于PEF對食品組分結(jié)構(gòu)和功能的作用及對食品質(zhì)量與安全的影響等基礎(chǔ)理論還需進(jìn)一步完善,同時,PEF設(shè)備的處理量、PEF處理引起的物料溫度升高、食品物料受PEF作用的不均勻性及設(shè)備投入等這些制約著PEF在食品工業(yè)中進(jìn)一步應(yīng)用。因此掌握PEF對食品中主要組分的作用機(jī)理及其對食品品質(zhì)和安全的影響,找到PEF作用下食品組分的穩(wěn)定方法是解決這些瓶頸問題的基本途徑。除此之外,盡管在生產(chǎn)線中引入PEF單元較容易,但是,食品組分由于不同介電性質(zhì),PEF會對這種不均一的產(chǎn)品性狀產(chǎn)生不同的效果,因此,相對于簡單的懸浮系統(tǒng),PEF應(yīng)用于較復(fù)雜的真實(shí)食品體系中具有一定的挑戰(zhàn)性。隨著PEF在食品加工中的應(yīng)用越來越廣泛,展現(xiàn)出來的局限性和瓶頸也越來越明顯。通過豐富的基礎(chǔ)理論探索促進(jìn)PEF技術(shù)的工業(yè)化進(jìn)程,是該技術(shù)發(fā)展應(yīng)用亟待解決的問題。