付文亮，邵春燕，崔鼎豪，陳志宏△

（1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室， 河北承德 067000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八一醫(yī)院口腔科；3.新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系）

近幾十年來，納米微粒在抗癌藥物載藥體系中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)的抗癌藥物相比，納米載藥體系具有更高的腫瘤微環(huán)境靶向選擇性和實(shí)體瘤高通透性[1]。與其它載藥體系相比，生物源性碳酸鈣納米微粒（calcium carbonate nanoparticles，CCNPs）具有良好的生物相容性、生物降解性和pH敏感性，展現(xiàn)了作為載藥體系的強(qiáng)大潛力[2]。本課題組前期研究已經(jīng)成功用海扇殼制備了CCNPs，并發(fā)現(xiàn)阿霉素裝載的CCNPs能有效殺滅骨肉瘤細(xì)胞，所使用的海扇貝由純文石型碳酸鈣自然組成[3-4]。但是，目前國內(nèi)外還沒有相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道CCNPs體內(nèi)注射的安全劑量。本研究將首次探討靜脈注射海扇殼源性CCNPs在大鼠體內(nèi)的急性毒性效應(yīng)，為CCNPs在生物醫(yī)學(xué)和藥物應(yīng)用中的安全性評價(jià)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品與動(dòng)物 海扇殼購自馬來西亞當(dāng)?shù)厥袌?，十二烷基二甲基胺乙?nèi)酯（dodecyl dimethyl betaine，BS-12）購自美國Sigma-Aldrich公司。

五周齡清潔級雌性SD大鼠，重量140～170g，購自于馬來西亞博特拉大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物資源部門，飼養(yǎng)于恒溫（25±3℃）、恒濕（55±5%）的環(huán)境中。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案由博特拉大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：UPM/IACUC/AUP-R027/2015)。

1.2 CCNPs的制備 將洗凈干燥的海扇殼打碎研磨，過75 μ m實(shí)驗(yàn)篩得到微米級的粉末。5g微米級粉末加50ml去離子水在磁力攪拌器中70℃、1300r/min攪拌1h；將1ml BS-12加入到上述混懸液中，室溫、1000r/min攪拌110min；過濾收集CCNPs，于70℃烘箱中干燥2d，備用。使用前紫外線照射CCNPs粉末滅菌2h，用無菌生理鹽水配制成所需濃度。

1.3 CCNPs表面形態(tài)的觀察 透射電子顯微鏡觀察CCNPs的形狀并測量大小。

1.4 14天重復(fù)劑量毒性試驗(yàn) SD大鼠隨機(jī)分為四組，CCNPs低、中、高劑量組和對照組，每組6只。CCNPs低（30mg/kg/d）、中（60mg/kg/d）、高（120mg/kg/d）劑量組大鼠分別給予不同劑量的CCNPs尾靜脈注射，連續(xù)14d；對照組大鼠每天給予等量生理鹽水尾靜脈注射，連續(xù)14天。

1.4.1 毒性反應(yīng)觀察和體重測量：每天觀察大鼠的死亡情況、毒性反應(yīng)和行為異常，如皮膚、皮毛、眼睛或自主活動(dòng)的改變，步態(tài)和姿勢的變化；同時(shí)，每天記錄大鼠的體重。

1.4.2 組織病理學(xué)檢查：分別取大鼠肝臟、肺、脾、腎和心臟，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，HE染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以（±s）的形式表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCNPs的形貌與表面特性 透射電子顯微鏡下觀察顯示，本研究制備的CCNPs為球形，直徑為20～60nm，為多孔性質(zhì)（圖1）。CCNPs的多孔特性有助于其通過物理吸附作用裝載藥物到納米粒子。

圖1 透射電子顯微鏡下CCNPs的形貌

2.2 14天重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)

2.2.1 各組大鼠的生存率和毒性反應(yīng)觀察：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，低劑量組和對照組大鼠生存率為100.00%（6/6），中劑量組大鼠生存率為66.67%（4/6）、高劑量組大鼠生存率為50.00%（3/6）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，低劑量組大鼠日常表現(xiàn)與對照組大鼠無明顯差別；在中劑量組和高劑量組，一些大鼠出現(xiàn)皮毛粗糙、自發(fā)活動(dòng)減少等表現(xiàn)。CCNPs三個(gè)劑量組大鼠均未發(fā)現(xiàn)注射部位局部損傷病變。

2.2.2 各組大鼠的體重：在實(shí)驗(yàn)過程中，CCNPs各給藥組和對照組大鼠的體重均逐漸增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CCNPs低劑量組、中劑量組大鼠體重與對照組大鼠相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；CCNPs高劑量組大鼠體重顯著低于對照組大鼠(P＜0.05)。見圖2：

圖2 各組大鼠體重的變化

2.2.3 組織病理學(xué)觀察：主要臟器的病理學(xué)變化見圖3。⑴肝臟：低劑量組，大鼠肝細(xì)胞仍以條索狀排列，可見輕度的空泡變性和淋巴細(xì)胞浸潤；中、高劑量組，大鼠肝細(xì)胞排列輕度紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)空泡增多，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。⑵肺：與對照組相比，低劑量組大鼠肺泡間隔膜增厚且伴有炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)中可見輕度肉芽腫形成；在中、高劑量組，大鼠肺可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間質(zhì)增厚及大量肉芽腫形成。⑶脾：CCNPs各給藥組大鼠脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯病理變化，尤其是中、高劑量組大鼠，且高劑量大鼠脾臟白髓的輪廓不規(guī)則或消失。⑷心臟：低劑量組，大鼠心臟切片可見輕度炎性細(xì)胞浸潤；中劑量組，大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)中有明顯擴(kuò)張充血的血管，紅細(xì)胞外滲和中度炎性細(xì)胞浸潤；高劑量組，大鼠心肌纖維腫脹、斷裂甚至壞死，伴有嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞浸潤。⑸腎：低劑量組，大鼠腎臟切片未見明顯病理改變；中、高劑量組，大鼠腎臟切片可見明顯病理變化，如腎小球萎縮和系膜區(qū)明顯增寬，擴(kuò)張毛細(xì)血管內(nèi)淤血明顯。

圖3 大鼠各臟器HE染色結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)抗癌藥物由于缺乏對腫瘤組織細(xì)胞的靶向性，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損害正常的組織細(xì)胞，造成劑量相關(guān)的毒副作用[5-6]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，具有腫瘤組織細(xì)胞靶向性的納米載藥體系可以在增加藥物抗癌效果的同時(shí)，減少對正常組織的毒副作用。作為具有良好生物相容性載藥體系的CCNPs，至今其體內(nèi)使用的安全劑量及具體的生物學(xué)效應(yīng)尚不清楚。為此，本研究采用14天連續(xù)靜脈注射的給藥方式，初步探究了不同劑量CCNPs對雌性SD大鼠的急性毒性作用。

本研究顯示，CCNPs低劑量組大鼠全部存活，中、高劑量組大鼠存活率分別為66.67%和50.00%，并且大鼠死亡之前均出現(xiàn)了不規(guī)則呼吸和嚴(yán)重嗜睡等毒性反應(yīng)。體重減輕是一個(gè)簡單而靈敏的毒性實(shí)驗(yàn)指標(biāo)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCNPs低、中劑量組大鼠體重與對照組大鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量組大鼠的體重與對照組比較明顯降低。本研究結(jié)果提示，高劑量CCNPs連續(xù)14天靜脈注射可能通過影響雌性大鼠的正常代謝導(dǎo)致了大鼠體重增長的減慢；同時(shí)，高劑量組中部分大鼠出現(xiàn)了皮毛粗糙、自發(fā)活動(dòng)減少等毒性反應(yīng)的表現(xiàn)。

組織病理學(xué)分析是觀察藥物毒性作用引起器官微觀結(jié)構(gòu)變化的可靠方法[8]。本研究組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，CCNPs暴露引起的組織病理學(xué)改變主要是肺、肝、脾、腎和心臟的炎性細(xì)胞浸潤，其機(jī)制可能是納米微粒進(jìn)入體內(nèi)激活了機(jī)體的免疫應(yīng)答，在免疫應(yīng)答期間促炎性細(xì)胞因子釋放增加，進(jìn)而可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)或細(xì)胞損傷的發(fā)生[9]。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，CCNPs低劑量組大鼠肝臟、脾、肺、心臟和腎臟的病理變化較輕或未觀察到明顯病理變化，而中、高劑量組大鼠各臟器的病理變化明顯較重。

綜上所述，雌性大鼠14天重復(fù)劑量急性毒性實(shí)驗(yàn)中，小劑量的CCNPs靜脈給藥不會(huì)引起嚴(yán)重的急性毒性反應(yīng)，即CCNPs對于雌性大鼠的安全劑量為≤30mg/kg，本研究可為CCNPs在生物醫(yī)學(xué)和藥物應(yīng)用中的安全性評價(jià)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。