胡 葉 周 琴 李善君 馮寶約 楊 瑩 左明煥

腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有賴(lài)于血管生成。血管生成是一個(gè)多因素參與、多步驟復(fù)雜的過(guò)程，它與腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均密切相關(guān)[1]。VEGFR-2做為VEGF受體，主要與調(diào)控血管生成有關(guān)。VEGF/VEGFR-2構(gòu)成調(diào)控腫瘤血管生成的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途徑[2]。

華蟾素注射液是由中華大蟾蜍陰干的全皮中提取制成的水溶性注射液。實(shí)驗(yàn)研究表明，華蟾素具有提高患者免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等功能[3]。本文通過(guò)四甲基偶氮唑鹽(MTT)實(shí)驗(yàn)、倒置熒光顯微鏡實(shí)時(shí)成像技術(shù)和酶聯(lián)免疫(ELISA)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比觀察華蟾素注射液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和VEGF表達(dá)的影響，探討華蟾素注射液抑制惡性腫瘤血管生成的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)一株，購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。HUVEC使用Endothelial cell medium(ECM)完全培養(yǎng)基(內(nèi)含 5% 胎牛血清、10 μl/ml ECGS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素)。人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。SW480細(xì)胞使用DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)含(10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素)。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、傳代和收獲，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于研究。包裝細(xì)胞PT-67 RFP，包裝細(xì)胞PT-67 H2b GFP 由安泰康生物技術(shù)有限公司構(gòu)建提供。

1.2 藥品和試劑

華蟾素注射液(5 ml，500 mg/ml)購(gòu)自安徽華潤(rùn)金蟾有限公司，用時(shí)使用對(duì)應(yīng)細(xì)胞完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。Endothelial cell medium(ECM)培養(yǎng)基套裝購(gòu)自ScienCell，PBS購(gòu)自CORNING公司，0.05%胰酶、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，DMSO、MTT購(gòu)自Amresco公司，Geneticin(G418 Sulfate)購(gòu)自Gibco，Hygromycin B購(gòu)自Invitrogen，Human VEGF HUMAN ELISA Kit 購(gòu)自eBioscience公司，Human VEGFR-2 Elisa BMS2019 購(gòu)自eBioscience公司。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以4×103個(gè)/孔接種于96孔板中，用培養(yǎng)液定容至總體積200 μl，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，加入待測(cè)藥物，分為空白對(duì)照組、華蟾素組，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔，分別于加藥后24 h、48 h、72 h進(jìn)行MTT 檢測(cè)，每孔加入20 μl的MTT溶液，CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，去上清，加入100 μl/孔DMSO溶液，充分溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的OD值。

1.4 倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

1.4.1 雙色熒光細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雙色熒光細(xì)胞，即細(xì)胞核穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP，green fluorescent protein)，細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP，red fluorescent protein)，是通過(guò)將綠色熒光蛋白特異性轉(zhuǎn)入已有的表達(dá)RFP細(xì)胞的細(xì)胞核中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。將包裝細(xì)胞 PT-67 H2b RFP 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，收集培養(yǎng)4 h的新鮮上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾后，分別對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行2～4次轉(zhuǎn)染，48～72 h后可見(jiàn)部分細(xì)胞質(zhì)表達(dá)紅色熒光蛋白，用50、100、200 μg/ml潮霉素B及400、800、1 000 μg/ml的G418進(jìn)行篩選。1～2周后選取雙色細(xì)胞比例大，細(xì)胞狀態(tài)好的組進(jìn)行單克隆篩選，以1 cell/孔接種96孔板，1周后尋找有單克隆形成的孔，待細(xì)胞數(shù)量>200 cell時(shí)，進(jìn)行消化擴(kuò)培，選取熒光最亮的克隆保種得到HUVE RFP和SW480 RFP。然后將對(duì)數(shù)期的包裝細(xì)胞PT-67 H2b GFP收集上清并過(guò)濾，分別對(duì)HUVE RFP和SW480 RFP進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染、篩選及單克隆方法同上，最終得到雙色熒光轉(zhuǎn)染的HUVEC細(xì)胞(HUVEC DUAL)和雙色熒光轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞(SW480 DUAL)。

1.4.2 熒光顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察 將雙色熒光細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，0.05%胰酶消化收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)4×103cell/孔體積200 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁過(guò)夜后上樣，分別設(shè)置空白對(duì)照組及華蟾素組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，CO2培養(yǎng)箱孵育0，24 h，48 h，倒置熒光顯微鏡進(jìn)行成像，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 酶聯(lián)免疫法(Elisa)檢測(cè) VEGF、VEGFR-2 表達(dá)

1.5.1 Elisa法檢測(cè)VEGF表達(dá) 取空白對(duì)照組及華蟾素組干預(yù)48 h后的細(xì)胞上清液，1 000 r/min 離心20 min再取上清，嚴(yán)格按照VEGF HUMAN ELISA Kit試劑盒說(shuō)明操作，將不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)品以及不同組的細(xì)胞上清液于酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm吸光度值和上清中VEGF吸光度值，計(jì)算VEGF含量。

1.5.2 Elisa法檢測(cè)VEGFR-2表達(dá) 將空白組及華蟾素組干預(yù)48 h后的細(xì)胞上清棄掉，加細(xì)胞裂解液，離心后取上清，按照Human VEGFR-2 Elisa BMS2019說(shuō)明操作，將不同濃度的VEGFR-2標(biāo)準(zhǔn)品以及不同組的細(xì)胞上清液于酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm吸光度值和上清中VEGFR-2吸光度值，計(jì)算VEGFR-2含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 華蟾素注射液對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響

3個(gè)濃度的華蟾素組與對(duì)照組相比，培養(yǎng)24 h OD值均無(wú)明顯差異，培養(yǎng)48 h后有3組OD值低于正常對(duì)照組(P<0.05)，72 h后華蟾素的抑制作用減弱，僅2組低于對(duì)照組(P<0.05)。表明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，培養(yǎng)24 h 華蟾素對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯作用，48 h表現(xiàn)出對(duì)HUVEC的最大抑制作用，72 h時(shí)抑制作用減弱，見(jiàn)表1。

2.2 華蟾素注射液對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示，華蟾素能顯著抑制 SW480 細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力，且呈一定的量效與時(shí)效關(guān)系。作用24、48及72 h后，高劑量華蟾素濃度組與空白對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？梢?jiàn)藥物濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，華蟾素對(duì)SW480細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)(表2)。

表1 華蟾素處理HUVEC細(xì)胞的 OD值

注：*為與空白對(duì)照組同期相比，P<0.05；**為與空白對(duì)照組同期相比，P<0.01。

表2 華蟾素處理HUVEC細(xì)胞的 OD值

注：*為與空白對(duì)照組同期相比，P<0.05；**為與空白對(duì)照組同期相比，P<0.01。

2.3 不同濃度的華蟾素干預(yù)HUVEC細(xì)胞形態(tài)對(duì)比

隨著華蟾素濃度的增高和時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到抑制，但未見(jiàn)明顯的細(xì)胞核異常，沒(méi)有明顯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

2.4 不同濃度的華蟾素干預(yù)SW480細(xì)胞形態(tài)對(duì)比

華蟾素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480有明顯的增殖抑制、誘發(fā)凋亡的作用，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)和濃度增加，抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用越強(qiáng)。

2.5 HUVEC細(xì)胞中VEGF及其受體含量變化

通過(guò)VEGF Elisa試劑盒測(cè)定華蟾素組(0.01 mg/ml、0.1 mg/ml、1 mg/ml)實(shí)驗(yàn)表明不同濃度的華蟾素注射液不能抑制HUVEC細(xì)胞分泌的VEGF，各濃度組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而HUVEC細(xì)胞膜表面VEGFR-2在華蟾素作用下降低，降低差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明華蟾素呈濃度依賴(lài)性抑制HUVEC細(xì)胞表面的VEGFR-2，但對(duì)細(xì)胞表達(dá)的VEGF無(wú)影響，見(jiàn)表3。

表3 華蟾素干預(yù)HUVEC細(xì)胞48 h后VEGF及VEGFR-2表達(dá)情況

注：*為與空白對(duì)照組同期相比，P<0.05；**為與空白對(duì)照組同期相比，P<0.01；△為與華蟾素其他濃度組同期相比，P<0.01。

2.6 SW480細(xì)胞中VEGF及其受體含量變化

通過(guò)VEGF Elisa試劑盒測(cè)定華蟾素組(1 mg/ml、10 mg/ml、100 mg/ml)作用48 h后VEGF蛋白的表達(dá)量分別是：(271.10±0.32)pg/ml，(240.99±18.63)pg/ml，(207.76±18.97)pg/ml，與空白對(duì)照組(285.65±31.12)pg/ml相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VEGFR-2在不同濃度華蟾素注射液的變化趨勢(shì)與VEGF相似。說(shuō)明華蟾素呈濃度依賴(lài)性抑制 SW480 細(xì)胞表達(dá)VEGF及VEGFR-2，見(jiàn)表4。

3 討論

惡性腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有賴(lài)于血管生成，惡性腫瘤血管在細(xì)胞組成、組織結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)上與正常血管有明顯差異。例如，腫瘤血管管壁并非由單一的內(nèi)皮細(xì)胞層構(gòu)成，單純腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間均可形成血管壁內(nèi)層細(xì)胞。此外，研究表明，抑制正常組織血管生成的調(diào)控機(jī)制并不能控制腫瘤血管生成[4]。

華蟾素是1種具有抗腫瘤作用的傳統(tǒng)中藥，在臨床中得到了廣泛應(yīng)用[3]。 袁莉等[5]分析102例接受華蟾素灌注的惡性腹水患者，有效率為65.7%，并顯示華蟾素能使惡性腹水顏色由紅色轉(zhuǎn)為淡黃色。左明煥等[6]對(duì)濕熱型惡性腹水患者60例進(jìn)行研究，結(jié)果華贍素腔內(nèi)灌注組優(yōu)于白介素-2腹腔灌注組。孫韜等[7-8]使用華蟾素注射液灌注治療晚期肺癌惡性心包積液可有效控制其增長(zhǎng)，毒副作用小，可耐受，一定程度上能夠改善患者的生活質(zhì)量并延長(zhǎng)生存。劉傳波等[9]發(fā)現(xiàn)華蟾素膀胱灌注聯(lián)合血凝酶可有效控制膀胱癌血尿，減少膀胱出血，改善患者生活質(zhì)量?？梢?jiàn)，華蟾素在機(jī)體體內(nèi)能夠有效抑制惡性腫瘤血管的產(chǎn)生和增殖。

表4 華蟾素作用SW480細(xì)胞48h后VEGF及VEGFR-2表達(dá)情況

注：*為與空白對(duì)照組同期相比，P<0.05；**為與空白對(duì)照組同期相比，P<0.01。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在華蟾素注射液干預(yù)下的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，在有效治療劑量范圍內(nèi)，華蟾素能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；對(duì)于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞，華蟾素的作用僅表現(xiàn)為一過(guò)性的抑制，同時(shí)不能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。VEGF及其受體表達(dá)方面，華蟾素有效降低腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白含量，且該抑制作用呈量效性和實(shí)效性；同時(shí)華蟾素能夠抑制正常血管內(nèi)皮細(xì)胞膜VEGFR-2受體的表達(dá)，但對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VEGF無(wú)明顯抑制作用。由此，課題組推斷華蟾素能夠選擇性作用于腫瘤細(xì)胞及惡性腫瘤血管，抑制其生長(zhǎng)和增殖，同時(shí)不會(huì)引起正常血管細(xì)胞的損傷，是一種潛在抗腫瘤血管生成的藥物，其作用機(jī)理可能是阻斷了腫瘤細(xì)胞所表達(dá)VEGF與正常內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的VEGFR-2受體結(jié)合，抑制腫瘤新生血管生成。

目前，用于腫瘤治療的藥物大多數(shù)缺乏腫瘤細(xì)胞靶向性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也殺傷大量骨髓及其他正常的增殖旺盛細(xì)胞，產(chǎn)生嚴(yán)重的不良事件，使病人難以承受?，F(xiàn)臨床常用的抗腫瘤血管藥物作用機(jī)理多為干擾或阻斷單一1個(gè)因子涉及的途徑，雖然可以抑制腫瘤的血管生成，但容易誘發(fā)腫瘤援救反應(yīng)，難以達(dá)到令人滿意的治療效果[10]。華蟾素作為中藥制劑，能夠多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的對(duì)抗惡性腫瘤血管的生成和增殖，其療效顯著，毒副作用小，耐受性強(qiáng)，適于臨床推廣，其抗腫瘤血管生成的機(jī)理仍需進(jìn)一步研究和完善。