徐 陽(yáng)， 單柏宇， 徐偉男， 鮑慧瑋

（1. 長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥品食品學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春130031； 2. 白城市食品藥品檢驗(yàn)所， 吉林 白城137000； 3. 呼倫貝爾北方藥業(yè)有限公司， 內(nèi)蒙古 呼倫貝爾022150； 4. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 吉林長(zhǎng)春130117）

滌痰丸收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑） 》 第二冊(cè)（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)WS3-B-0386-90）， 是由牽牛子（炒）、 大黃、 黃芩3 味藥材與百草霜、 煅金礞石粉末、 桃膠一起配研、 熔化制成的褐黃色水丸， 具有清熱化痰、 開(kāi)郁化痞的功效， 臨床上用于痰火郁結(jié)、 氣急瘋癇、 濕熱咳嗽、 胸滿作喘、 痰涎壅盛、 大便燥結(jié)［1-2］。 其中，大黃素、 大黃酸、 兒茶素、 沒(méi)食子酸、 阿魏酸是大黃主要藥效成分， 具有瀉下攻積、 清熱瀉火、 逐瘀通經(jīng)、 抗病原微生物、 抗炎、 止血等作用［3-4］； 黃芩苷是黃芩主要藥效成分， 具有清熱燥濕、 瀉火解毒、 止血、 抗炎等作用［5-6］； 大黃素、 咖啡酸是牽牛子（炒） 的主要藥效成分， 具有治療水腫脹滿、二便不通、 痰飲積聚、 氣逆喘咳等作用［7］。 然而，目前滌痰丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善， 尚無(wú)針對(duì)其含有量測(cè)定的方法， 故本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定其中沒(méi)食子酸、 兒茶素、 咖啡酸、 大黃酸、 大黃素、 阿魏酸、 黃芩苷的含有量， 為該制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀， 配置DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）； AB135-S 型電子分析天平［梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海） 有限公司］； DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）； R 系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）； KQ-250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 滌痰丸（按照標(biāo)準(zhǔn)處方及制備工藝自制）。 沒(méi)食子酸 （批號(hào)110831-201204）、 兒茶素（批 號(hào) 877-200001）、 咖 啡 酸 （ 批 號(hào) 110885-200102）、 大黃酸（批號(hào)110757-2000206）、 大黃素（批號(hào)110756-200110）、 阿魏酸（批號(hào)110773-200611）、 黃芩苷（批號(hào)110715-201318） 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。 甲醇為色譜純； 其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相甲醇（A） -0.1%磷酸（B）， 梯度洗脫， 程序見(jiàn)表1； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)254、 278、320 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取沒(méi)食子酸、 兒茶素、 咖啡酸、 大黃酸、 大黃素、 阿魏酸、 黃芩苷對(duì)照品適量， 置于10 mL 量瓶中， 甲醇溶解并定容至刻度，制得每1 mL 分別含沒(méi)食子酸349.3 μg、 兒茶素584.3 μg、 咖啡酸0.943 5 μg、 大黃酸134.4 μg、大黃 素53.32 μg、 阿 魏 酸1.636 μg、 黃 芩 苷863.8 μg的溶液， 即得。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2.2 供試品溶液 本品研細(xì)， 精密稱取約0.5 g粉末， 置于具塞錐形瓶中， 加入10 mL 甲醇， 密塞， 稱定質(zhì)量， 超聲60 min， 放冷， 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過(guò)， 取續(xù)濾液， 即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方和工藝分別制備缺大黃、 缺牽牛子和大黃、 缺黃芩和大黃的陰性樣品， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備相應(yīng)溶液， 即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、 供試品、 陰性樣品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖1～3。 由圖可知， 各成分在相應(yīng)位置均無(wú)干擾， 表明該方法專屬性良好， 而且其色譜峰理論塔板數(shù)均大于3 000， 分離度均大于1.5。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取沒(méi)食子酸、 兒茶素、 咖啡酸、 大黃酸、 大黃素、 阿魏酸、 黃芩苷對(duì)照品適量， 甲醇制成2 794.4、 4 674.4、 7.548、1 075.2、 426.56、 13.088、 6 910.4 μg／mL 貯 備液， 依次稀釋1／2、 1／4、 1／8、 1／16、 1／32、 1／64倍， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以待測(cè)成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y）， 對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見(jiàn)表2， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液6 份， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得沒(méi)食子酸、 兒茶素、 咖啡酸、 大黃酸、 大黃素、 阿魏酸、 黃芩苷峰面積RSD 分別為0.98%、 0.68%、1.78%、 1.84%、 1.77%、 0.59%、 1.98%， 表 明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖（278 nm）Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents （278 nm）

圖2 各成分HPLC 色譜圖（320 nm）Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents （320 nm）

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

圖3 各成分HPLC 色譜圖（254 nm）Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents（254 nm）

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取本品粉末適量， 共6 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得沒(méi)食子酸、 兒茶素、咖啡酸、 大黃酸、 大黃素、 阿魏酸、 黃芩苷含有量RSD 分 別 為 1.98%、 1.90%、 1.96%、 1.77%、1.93%、 1.59%、 1.44%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液， 于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得沒(méi)食子酸、 兒茶素、 咖啡酸、大黃酸、 大黃素、 阿魏酸、 黃芩苷峰面積RSD 分別為0.75%、 1.80%、 1.98%、 1.96%、 1.82%、0.62%、 1.32%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的本品（批號(hào)20170501） 6 份， 每份約0.25 g， 精密加入對(duì)照品溶液， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算回收率。結(jié)果， 沒(méi)食子酸、 兒茶素、 咖啡酸、 大黃酸、 大黃素、 阿魏酸、 黃芩苷平均加樣回收率分別為99.77%、 99.84%、 100.55%、 98.74%、 99.67%、100.95%、 100.74%， RSD 分別為1.60%、 1.25%、1.84%、 1.77%、 1.08%、 1.58%、 0.86%。

2.4 樣品含有量測(cè)定 取3 批本品， 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)考察甲醇-水、 乙腈-水，甲醇-磷酸-水， 乙腈-磷酸-水體系， 發(fā)現(xiàn)在甲醇-水、 乙腈-水體系下沒(méi)食子酸和兒茶素有拖尾現(xiàn)象，而在甲醇-磷酸-水體系下各待測(cè)成分色譜峰峰形和分離度均良好。 另外， 由于待測(cè)成分多， 極性差異明顯， 流動(dòng)相極性跨度也較大， 故梯度變化不宜過(guò)快。 最終， 確定 “2.1” 項(xiàng)下流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC-DAD 檢測(cè)器， 在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行考察， 同時(shí)比較供試品中各待測(cè)成分色譜峰， 以物質(zhì)吸收大小和與其他色譜峰分離度作為指標(biāo)。 最終確定， 檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm （大黃酸、 大黃素）［8-10］、 278 nm （沒(méi)食子酸、 兒茶素、 黃芩苷）［11-13］、 320 nm （咖啡酸、 阿魏酸）。

3.3 供試品制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了超聲提取法、 熱回流提取法、 索氏提取法、 浸漬法的提取效果， 最終選擇超聲提取法， 該方法具有較高的提取率， 而且可保護(hù)一些熱敏性物質(zhì)不被破壞。 然后， 比較了乙醇、 甲醇、 三氯甲烷、 石油醚的提取效果， 最終選擇甲醇作為提取溶劑。