周苗苗， 張 霞， 李治芳， 王文蘋，2，3?

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 寧夏 銀川750004； 2. 寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心， 寧夏 銀川750004；3. 回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室， 寧夏 銀川750004）

作為制備載藥緩釋微球最常用的方法， 乳化-溶劑揮發(fā)法工藝過程中因所用溶劑理化性質(zhì)、 移除速率的差異， 可影響微球形態(tài)、 粒徑、 釋藥速率等性能［1］。 其中， 二氯甲烷是制備微球最常用的有機溶劑， 當(dāng)與其他溶劑混合制備微球時， 可與藥物、 載體、 內(nèi)外相間產(chǎn)生相互作用， 進而影響載藥微球性能， 故考察溶劑體系與微球常規(guī)性能之間的相關(guān)性具有重要意義。

丹參酮ⅡA是丹參中提取得到的脂溶性菲醌類化合物， 對冠心病、 心絞痛、 心律失常等療效顯著， 臨床應(yīng)用廣泛［2］， 該成分微溶或部分溶于水［3］， 自身具有熒光特性［4］， 有利于在激光共聚焦顯微鏡下直接觀測藥物分布特征。 因此， 本實驗以其為模型藥物， 采用二氯甲烷及其混合溶劑體系制備丹參酮ⅡA-PLGA 微球， 通過熒光分析考察混合溶劑對微球中藥物分布的影響， 并嘗試將溶劑特征與微球性能相關(guān)聯(lián)。

1 材料

PL203 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］； QL-861 渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）； T10BS25 均質(zhì)機（德國IKA 公司）； DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）； FD-1C 冷凍干燥機（北京德天佑儀器有限公司）； THI-100 恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）； Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； Microtrac X-100 粒徑測定儀（美國霍尼韋爾公司）； FV1000-IX81 激光掃描共聚焦顯微鏡 （日本Olympus公司）。

丹參酮ⅡA（南京景竹生物科技有限公司， 批號JZ2015082403）。 聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA） （90 kDa， 50／50， 山東省醫(yī)療器械研究所，批號16030206）； 聚乙烯醇1788 型［阿拉丁試劑（上海） 有限公司， 批號G1509033］。 二氯甲烷、乙酸乙酯、 丙酮、 二氧六環(huán)、 乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）； 其他試劑均為分析純； 水為純化水（實驗室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA平衡溶解度測定 分別取0.5 mL不同溶劑至離心管中， 加丹參酮ⅡA至過飽和， 置于恒溫氣浴搖床（25 ℃， 100 r／min） 中平衡48 h，8 000 r／min 離心5 min 后吸取上清液， 加甲醇稀釋一定倍數(shù)。 采用HPLC 法測定［5］［柱溫30 ℃； 檢測波長270 nm； 流動相甲醇-水（93 ∶7）； 體積流量1.0 mL／min］， 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸， 得回歸方程為Y＝0.018X - 0.157 （ R2＝0.999 9）， 在 1 ～250 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 再計算丹參酮ⅡA平衡溶解度， 并查閱相關(guān)文獻獲取溶劑的沸點、 黏度等有關(guān)參數(shù)［6］， 結(jié)果見表1。

表1 丹參酮ⅡA 平衡溶解度測定結(jié)果（±s， n＝3）Tab.1 Results of equilibrium solubility determination of tanshinoneⅡA （±s， n＝3）

表1 丹參酮ⅡA 平衡溶解度測定結(jié)果（±s， n＝3）Tab.1 Results of equilibrium solubility determination of tanshinoneⅡA （±s， n＝3）

溶劑 沸點（101.3 kPa）／℃ 黏度（20 ℃）／（mPa·s）極性 平衡溶解度／（g·100 mL-1）二氯甲烷 40 0.43 3.4 6.67±0.25二氧六環(huán) 101 1.54 4.8 1.30±0.03乙酸乙酯 77 0.45 4.3 0.35±0.01丙酮 56 0.32 5.4 0.44±0.02乙腈 81 0.36 5.8 0.20±0.01

2.2 微球制備 精密稱取PLGA 270 mg、 丹參酮ⅡA30 mg， 加入2 mL 混合溶劑， 渦旋溶解。 將上述溶液加到40 mL 聚乙烯醇（2%） 溶液中均質(zhì)剪切（8 000 r／min） 0.5 min 制備O／W 初乳， 轉(zhuǎn)入800 mL 聚乙烯醇（1%） 溶液中， 40 ℃下磁力攪拌3 h， 離心（3 000 r／min） 2 min 后收集微球，冷凍干燥， 即得。

2.3 載藥量、 包封率測定 精密稱取微球粉末10 mg， 加入0.3 mL 二氧六環(huán)溶解， 再加入適量甲醇至5 mL 量瓶中定容， 超聲30 min， 再離心（12 000 r／min） 5 min 取上清液， 按“2.1” 項下方法測定丹參酮ⅡA含有量， 計算載藥量、 包封率， 公式分別為載藥量＝ （微球中藥物含有量／微球質(zhì)量） ×100%、 包封率＝ （微球中藥物含有量／投藥量） ×100%， 結(jié)果見表2。 由表可知， 當(dāng)微球理論載藥量為10%時， 不同溶劑體系所得微球的包封率均約為90%， 表明O／W 法制備微球過程中藥物損失少， 這與丹參酮ⅡA水溶性較低有關(guān)； 二氯甲烷-丙酮載藥量和包封率最高， 并與二氯甲烷-乙酸乙酯比較有顯著差異（P＜0.05）， 這是由于丙酮能與水混溶， 并較其他3 種溶劑沸點更低， 能迅速擴散至外水相中， 使PLGA 快速沉積， 從而阻礙了藥物擴散損失［7］。

2.4 粒徑測定 取微球粉末約30 mg， 均勻分散于10 mL 0.5%聚乙烯醇溶液（含0.1%聚山梨酯-80） 中， 超聲10 min 后取適量混懸液， 采用粒徑測定儀測定， 結(jié)果見表2。 由表可知， 二氯甲烷與不同溶劑混合后制得微球的粒徑均約40 μm， 差異較小， 其原因可能是二氯甲烷所占溶劑比例大、 揮發(fā)快， 是影響微球成形的主要溶劑［8］。

表2 微球性能考察結(jié)果（±s， n＝3）Tab.2 Results of performance investigation of microspheres （±s， n＝3）

表2 微球性能考察結(jié)果（±s， n＝3）Tab.2 Results of performance investigation of microspheres （±s， n＝3）

注：與二氯甲烷-丙酮（2 ∶1）比較，?P＜0.05

溶劑 固含物／% 載藥量／% 包封率／% 粒徑／μm二氯甲烷-二氧六環(huán)（2 ∶1）15 9.26±0.11 92.56±1.12 41.68±24.89二氯甲烷-乙酸乙酯（2 ∶1）15 8.95±0.35? 89.48±3.48? 39.98±21.84二氯甲烷-丙酮（2 ∶1）15 9.80±0.12 98.01±1.18 38.72±22.60二氯甲烷-乙腈（2 ∶1）15 9.40±0.32 93.95±3.17 37.12±26.28

2.5 體外釋藥行為 精密稱取微球粉末10.0 mg，分散于10 mL pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（含2%聚山梨酯-20） 中［5］， 置于恒溫氣浴搖床上（120 r／min、37 ℃）， 分別于4 h 及3、 8、 18、 28、 38、 48、58、 68、 78、 88、 98 d 離心（3 000 r／min） 2 min，定量取上清液， 同時補充同溫等量緩沖液， HPLC法測定丹參酮ⅡA累積釋放量， 繪制體外釋放曲線， 結(jié)果見圖1。

圖1 微球體外釋放曲線Fig.1 In vitro release curves for microspheres

由圖可知， 不同混合溶劑中微球均呈現(xiàn)明顯緩釋效果， 突釋率均較低（4 h 釋放率約5%）， 28 ～68 d 釋藥速率明顯加快， 98 d 后基本完成釋藥行為； 二氯甲烷-二氧六環(huán)釋放最快， 可能是由于二氧六環(huán)沸點高， 固化過程中易殘留， 在微球冷凍干燥過程中形成微孔通道， 有利于釋放介質(zhì)滲入； 丙酮沸點低， 溶劑擴散速率快， 使得微球快速固化，表面較致密， 故二氯甲烷-丙酮釋放速率最低［9］。再采用方差分析進行組間相似性判定［10］， 發(fā)現(xiàn)二氯甲烷-二氧六環(huán)與二氯甲烷-乙酸乙酯、 二氯甲烷-乙酸乙酯與二氯甲烷-乙腈、 二氯甲烷-丙酮與二氯甲烷-乙腈之間的釋放行為無顯著差異， 其余各組之間有顯著差異。 最終， 測得釋放量在25% ～40%之間， 這可能是由于丹參酮ⅡA外部環(huán)境影響所致［3］， 隨著含水量增加及空氣（氧氣） 存在， 使得釋放介質(zhì)中該成分發(fā)生部分降解［11］。

2.6 藥物分布相關(guān)參數(shù)測定［12］采用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）， 取3 ～5 mg 微球于5 mL 離心管中， 加50 μL 純水振蕩1 min 使其分散均勻，吸取適量置于載玻片上， 將蓋玻片緩慢蓋于液滴上， 用封片劑封片， 543 nm 波長下觀察并拍攝各體系載藥微球， 結(jié)果見圖2。 由圖可知， 不同混合溶劑中微球熒光分布均由邊緣向中心減弱， 表明丹參酮ⅡA在微球固化過程中隨溶劑揮發(fā)而向外遷移， 最終趨于微球表面分布。

圖2 微球CLSM 圖Fig.2 CLSM images for microspheres

以二氯甲烷-二氧六環(huán)為例， 所得CLSM 圖在ImageJ-win32 軟件中將熒光強度轉(zhuǎn)換為數(shù)值信號，通過Origin 8.0 軟件繪制熒光強度-微球半徑圖， 所得曲線沿X 軸中心點對折。 在Analysis 模塊下， 曲線進行多項式回歸處理使其平滑， X、 Y 軸同時統(tǒng)一為100%； 截取從原點開始5%的Y 軸， 找到對應(yīng)X 軸的坐標(biāo)（圖3A）； Y 軸上余下的95%曲線進行Log10 回歸后曲線擬合， 得到曲線方程及斜率（圖3B）。 其中， 圖3A 中原點到5%Y 軸與所對應(yīng)的X 軸為曲線平緩區(qū)， 其半徑比代表藥物在球心分布的比例， 其值越大， 代表藥物在球心部分分布越多， 而上升區(qū)為剩余95% Y 軸與對應(yīng)的X 軸，并呈逐漸增加的趨勢， 表明趨于微球表面藥物分布越多［13］； 圖3B 中對數(shù)處理后的曲線與一元一次方程擬合度較高（R2＝0.99）， 方程斜率表示微球固化過程中藥物在微球表面擴散的速度， 斜率越大，表明藥物向微球邊緣擴散越快。 再比較各體系曲線擬合參數(shù)， 結(jié)果見表3。

圖3 CLSM 圖數(shù)據(jù)處理Fig.3 Data processing of CLSM images

表3 微球曲線擬合參數(shù)Tab.3 Curve fitting parameters for microspheres

由表可知， 各體系微球平緩區(qū)半徑比及上升區(qū)斜率從F1 到F4 逐漸增加， 呈正比關(guān)系。 聯(lián)合表1發(fā)現(xiàn)， 混合溶劑隨著其極性增加， 平緩區(qū)半徑比及上升區(qū)斜率提高， 這是由于二氯甲烷中引入極性較大（水溶性較大） 的乙酸乙酯、 二氧六環(huán)、 丙酮、乙腈， 雖然沸點高于二氯甲烷， 但它們可顯著增加混合溶劑在第二相中的溶解度， 在形成O／W 初乳后可較快地被萃取或擴散至水相中。 因此， 在該溶劑中溶解度較好的丹參酮ⅡA易隨溶劑擴散至微球表面， 并發(fā)生沉積［14］。

2.7 微球性能與溶劑性質(zhì)的相關(guān)性 通過SPSS 17.0 軟件， 對突釋量［15］、 包封率、 上升區(qū)斜率，以及各溶劑沸點、 極性、 黏度、 飽和溶解度進行相關(guān)性回歸分析， 結(jié)果見圖4。 由圖可知， 藥物突釋量與其在溶劑中的平衡溶解度、 溶劑黏度呈正相關(guān)關(guān)系， 如藥物二氧六環(huán)中溶解性最好， 導(dǎo)致微球在固化過程中隨著溶劑揮發(fā)更易將藥物帶到表面， 使其突釋增加， 結(jié)合圖2 可知藥物更趨向表面分布［12］； 微球包封率、 上升區(qū)斜率與溶劑極性呈正相關(guān)關(guān)系， 表明溶劑極性是固化過程中影響藥物遷移速率的主要因素［16］； 包封率與溶劑沸點成反比，溶劑沸點越高， 則其在微球固化過程中不易除去，導(dǎo)致藥物突釋增加［17］； 除二氯甲烷以外的溶劑改變了體系黏度， 黏度越大， PLGA 越易沉積， 進一步阻礙藥物向外遷移， 故斜率與溶劑黏度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖4 微球性能與溶劑性質(zhì)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of microsphere performance and solvent properties

3 討論

本實驗采用O／W 法制備丹參酮ⅡA-PLGA 微球， 體外釋放結(jié)果表明， PLGA 在40 d 左右降解，釋放98 d 后殘余微球中丹參酮ⅡA很少， 幾乎可忽略不計。 由此推測， 累積釋藥率較低的主要原因可能是該成分從微球釋放至介質(zhì)中后， 在水性環(huán)境和光熱作用下發(fā)生一定程度的降解［3，11］。

微球的粒徑、 載藥量、 包封率、 體外釋放是評價制劑的重要指標(biāo)， 在乳化-溶劑揮發(fā)法制備微球過程中， 通常選用沸點低、 易揮發(fā)的有機溶劑， 如二氯甲烷、 乙酸乙酯等。 作為乳液法制備微球的“隱形” 因素， 溶劑主要發(fā)揮溶解聚合物與藥物、影響微球固化過程、 形成特定形態(tài)表面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)的微球等作用［18］。

迄今已有許多文獻報道了溶劑在微球領(lǐng)域的應(yīng)用， 主要可分為以下幾類： （1） 溶劑影響微球的分布， 不同溶劑具有不同物理性質(zhì)（如黏度、 表面張力、 水中溶解度、 蒸氣壓等） 及對藥物、 載體材料的溶解能力， 這些都將直接影響微球粒徑、載藥量、 包封率， 從而影響微球穩(wěn)定性、 體外釋放等［19］； （2） 溶劑可制備安全性更高的載藥微球，評價微球性能優(yōu)劣的參數(shù)之一為終產(chǎn)物溶劑殘留量， 乳液法所用的有機溶劑具有一定毒性， 而且該方法制備微球時溶劑易殘留， 故選用毒性較小的溶液制備PLGA 微球， 并通過溶劑萃取使其殘留量減少， 可提高微球的生物安全性［20］； （3） 溶劑可用于制備功能型PLGA 微球， 沸點低、 與水相容性好的單一溶劑與混合溶劑可制備外觀形態(tài)不同的多孔、 中空型PLGA 微球， 進而影響微球性能［21］。本實驗發(fā)現(xiàn)， 溶劑在乳液法制備微球過程中具有重要作用， 不同溶劑制得微球的藥物分布差異較大，但影響其形成及性能的機制有待系統(tǒng)深入的研究。

4 結(jié)論

本實驗通過O／W 法制備丹參酮ⅡA-PLGA 微球， 考察混合溶劑性質(zhì)對微球性能的影響， 并將兩者進行關(guān)聯(lián)分析， 發(fā)現(xiàn)盡管混合溶劑均以二氯甲烷為主， 但其對微球仍有較大影響（主要涉及載藥量、 體外釋放、 藥物分布等）， 而且其特性與溶劑特征參數(shù)之間具有顯著相關(guān)性。 綜上所述， 研究可為微球成形及其調(diào)控機制的研究奠定基礎(chǔ)， 有利于優(yōu)化處方工藝， 并更好地調(diào)節(jié)微球載藥、 釋藥行為。