劉祖望， 許夢(mèng)捷， 黃 真， 程汝濱， 鐘曉明

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)， 浙江 杭州310053）

多酚是一類含有羥基和苯環(huán)的極性化合物， 包括類黃酮、 酚酸、 單寧（水解和縮合）、 二苯乙烯、 木質(zhì)素等， 主要分布在植物的葉、 花、 果實(shí)中， 對(duì)人體健康和營(yíng)養(yǎng)平衡具有重要作用［1］， 在抗炎、 抗腫瘤、 護(hù)肝、 抗氧化、 清除自由基、 抑菌等方面具有良好的作用， 顯示了廣泛的應(yīng)用前景［2-4］。 此外， 該成分還能有效抑制活性氧及自由基所造成的機(jī)體損傷［5］， 吸收日光中大部分200 ～300 nm 強(qiáng)紫外線輻射， 起到“紫外線過(guò)濾器” 作用［6］。 因此， 在日本有人將植物多酚稱為繼第六營(yíng)養(yǎng)素膳食纖維之后的“第七類營(yíng)養(yǎng)素”［7］。

刺梨為薔薇科植物單瓣繅絲花Rosa roxburghii Tratt.、 繅 絲 花 Rosa roxburghii Tratt. f. normalis Rehd. et Wils. 的果實(shí)， 又名茨梨、 木梨子、 文先果， 為貴州省少數(shù)民族用藥［8］， 其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有預(yù)防癌癥、 抗衰老、 抗動(dòng)脈粥樣硬化、 抗心血管疾病等作用［9-11］， 含有多酚、 黃酮、 多糖、 三萜等成分， 其中對(duì)黃酮、 多糖的研究相對(duì)較多［12-13］，而對(duì)多酚的研究尚處于起步階段， 研究表明該成分具有較強(qiáng)的清除自由基等藥理作用［14-15］。 為了更好地開發(fā)利用刺梨多酚， 本實(shí)驗(yàn)考察4 種大孔吸附樹脂對(duì)該成分的吸附和解吸性能， 以期優(yōu)化純化工藝， 為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)， 也有利于刺梨資源和相關(guān)產(chǎn)品的深入開發(fā)利用， 提高當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)水平。

1 材料

1.1 試藥 刺梨購(gòu)自香如故食品銷售有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為單瓣繅絲花Rosa roxburghii Tratt. 的干燥果實(shí)。乙醇 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， 批號(hào)20170317）； 無(wú)水碳酸鈉（寧波市化學(xué)試劑有限公司， 批號(hào)20070728）； 福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司， 批號(hào)818H017）； 沒食子酸對(duì)照品（北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司， 批號(hào)17022801）。 ADS-17、 HPD-600、 AB-8、 NKA-9 型大孔吸附樹脂購(gòu)自滄州寶恩吸附材料科技有限公司， 具體物理參數(shù)見表1。

表1 大孔吸附樹脂物理參數(shù)Tab.1 Physical parameters for macroporous adsorption resins

1.2 儀器 電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）； UV-1800 型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）； 恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；超聲波清洗機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）； 層析柱（1.0 cm×15.0 cm）。

2 方法及結(jié)果

2.1 多酚提取 干燥果實(shí)粉碎， 過(guò)50 目篩， 稱取適量粉末， 加入100 倍量70%乙醇， 250 W、 30 ℃下超聲提取40 min。 過(guò)濾， 濃縮， 得粗多酚浸膏。

2.2 多酚含有量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液制備 取適量粗多酚轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中， 蒸餾水定容， 搖勻， 即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品10.0 mg， 置于5 mL 棕色量瓶中， 蒸餾水定容，搖 勻， 得 2 mg／mL 母 液， 蒸 餾 水 稀 釋 至0.1 mg／mL， 即得。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 采用Folin-Ciocaltean 法測(cè)定多酚含有量［16］。 吸取對(duì)照品溶液120 μL， 置于錫箔紙包裹不透光的5 mL 離心管中， 加入蒸餾水至500 μL 后， 再加入0.5 mL 福林酚試劑， 混勻，避光反應(yīng)2 min， 接著加入2 mL 10%Na2CO3溶液，最后加入1 mL 蒸餾水， 搖勻， 置于40 ℃恒溫水浴鍋中暗浴30 min， 在200 ～800 nm 波長(zhǎng)處掃描。 最終確定， 檢測(cè)波長(zhǎng)為760 nm。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品溶液30、40、 60、 80、 100、 120、 140、 160、 180 μL， 置于錫箔紙包裹不透光的5 mL 離心管中， 按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理， 測(cè)定760 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。 以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸， 得到回歸方程為A ＝151.71X＋0.009 6 （R2＝0.999 5）， 在0.4～21.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液120 μL，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法于760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度， 連續(xù)6 次， 測(cè)得其RSD 為0.8%， 表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液， 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法于760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，連續(xù)6 次， 測(cè)得其RSD 為1.7%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液， 在0、 2、 4、8、 16、 24 h 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法于760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度， 測(cè)得其RSD 為2.8%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度已知的供試品溶液60 μL， 加入60 μL 對(duì)照品溶液混合， 同法制備6 份， 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法于760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度， 測(cè)得其平均加樣回收率為97.6%，RSD 為2.0%。

2.3 樹脂性能評(píng)價(jià)

2.3.1 預(yù)處理 將干凈樹脂用2 倍量95%乙醇浸泡24 h 以除雜， 并使其充分溶脹， 然后用95%乙醇淋洗至淋出液無(wú)白色渾濁， 再用蒸餾水淋洗至無(wú)醇味， 保存于蒸餾水中備用。

2.3.2 靜態(tài)吸附量、 解吸率的計(jì)算 將樹脂濾干，精密稱取1.0 g 于250 mL 具塞錐形瓶中。 取粗多酚1 g， 溶于200 mL 蒸餾水中， 測(cè)得其多酚質(zhì)量濃度（C0）， 取50 mL 加到含樹脂的錐形瓶中， 于30 ℃恒溫水浴鍋中水浴24 h， 定時(shí)搖晃， 每隔一段時(shí)間吸取上清液測(cè)定吸光度， 測(cè)得溶液中剩余多酚質(zhì)量濃度（C1）， 根據(jù)式（1） 計(jì)算靜態(tài)吸附量［16］（Qs表示吸附量， V 表示粗提液體積， M 表示樹脂質(zhì)量）。

然后， 將充分吸附24 h 的樹脂取出， 過(guò)濾，置于250 mL 具塞錐形瓶中， 加入70%乙醇50 mL，于30 ℃恒溫水浴鍋中水浴24 h， 定時(shí)搖晃， 每隔一段時(shí)間吸取上清液測(cè)定吸光度， 測(cè)得溶液中剩余多酚質(zhì)量濃度（C2）， 根據(jù)式（2） 計(jì)算解吸率（D 表示解吸率， V′表示解吸液體積， Q′表示吸附多酚量g）。

由圖1 可知， 4 種大孔吸附樹脂均可在短時(shí)間吸附大量多酚， 并且在吸附時(shí)間8 h 時(shí)基本達(dá)到平衡， 其中AB-8 型吸附量最大（8.19 mg／g）， 其次是 HPD-600 型 （ 7.87 mg／g ）、 NKA-9 型（6.69 mg／g）， ADS-17 型最小（4.17 mg／g）； 4 種大孔吸附樹脂在解吸初期均具有較大的解吸速率，并且在2 h 時(shí)基本達(dá)到平衡。 其中AB-8 型解吸率最大（91.47%）， 其次是ADS-17 型（87.55%），NKA-9 型、 HPD-600 型較小（71.78%、 63.72%）。綜上所述， AB-8 型大孔吸附樹脂不僅能在短時(shí)間內(nèi)吸附大量多酚， 而且解吸率高， 解吸速度快， 故選擇其作進(jìn)一步研究。

接著， 稱取5 g 樹脂裝柱， 取0.8 mg／mL 多酚粗提液， 以2 mL／min 體積流量過(guò)樹脂柱， 分段收集流出液， 每10 mL 為1 份， 共收集30 份， 測(cè)定各份流出液中多酚質(zhì)量濃度， 以其質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度的10% 作為泄露點(diǎn)， 100% 作為飽和點(diǎn)［17］。 再稱取5 g 樹脂充分吸附1 h， 70%乙醇以2 mL／min 體積流量解吸， 分段收集流出液， 每10 mL為1 份， 共收集20 份， 測(cè)定各份流出液中多酚質(zhì)量濃度。

由表2 可知， 隨著上樣液體積流量增大， 流出液中多酚含有量符合“S” 型增長(zhǎng)趨勢(shì)［18］， 流出

圖1 大孔吸附樹脂吸附、 解吸曲線Fig.1 Absorption and desorption curves for macroporous adsorption resins

60 mL 時(shí)， 流出液中多酚質(zhì)量濃度為0.08 mg／mL，到達(dá) 泄 露 點(diǎn)； 200 mL 時(shí)， 其 質(zhì) 量 濃 度 為0.79 mg／mL， 與原溶液基本一致， 到達(dá)飽和點(diǎn)，故確定上樣量為200 mL。 在解吸初始階段， 吸附在大孔樹脂上的多酚即大量吸出， 解吸液體積為20 mL 時(shí)， 流出液中多酚質(zhì)量濃度達(dá)到2.85 mg／mL； 40 mL 時(shí)， 其質(zhì)量濃度達(dá)到最大值5.87 mg／mL； 隨著體積進(jìn)一步增加， 其質(zhì)量濃度開始下降， 在160 mL 時(shí)僅為0.10 mg／mL， 可認(rèn)為解吸基本完成， 故確定解吸液體積為160 mL。

表2 曲線泄露、 解吸液體積Tab.2 Leakage and desorption solution volumes of curves

2.4 吸附單因素試驗(yàn) 固定相應(yīng)因素不變， 考察上樣液體積流量（1、 2、 3、 4、 5 mL／min）、 質(zhì)量濃度 （0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0 mg／mL）、 pH（4、 5、 6、 7、 8） 對(duì)吸附量的影響。

由圖2A 可知， 上樣液體積流量為1 mL／min時(shí)吸附量最大， 達(dá)到8.17 mg／g； 其體積流量逐漸增大時(shí)， 吸附量隨之減小， 在大于3 mL／min 時(shí)更顯著。 上樣液體積流量過(guò)大時(shí)， 多酚尚未被樹脂吸附即流出， 導(dǎo)致吸附量較小； 過(guò)小時(shí)， 會(huì)導(dǎo)致操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 增加成本， 而且在3 mL／min 時(shí)吸附量仍在7 mg／g 以上， 故選擇其作為響應(yīng)面水平。

由圖 2B 可知， 上樣液質(zhì)量濃度低于0.8 mg／mL時(shí)， 吸附量隨著其增大而顯著提高； 大于0.8 mg／mL 時(shí)， 吸附量趨于平穩(wěn)， 在1 mg／mL時(shí)達(dá)到最大值8.16 mg／g， 之后有下降趨勢(shì)。 上樣液質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)， 溶液中多酚尚未與樹脂充分接觸即吸出， 從而造成漏液現(xiàn)象； 過(guò)高時(shí)， 溶液中雜質(zhì)增多， 與多酚產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系， 導(dǎo)致吸附量較小，同時(shí)可能會(huì)生成沉淀， 故選擇0.8 mg／mL 作為響應(yīng)面水平。

由圖2C 可知， 吸附量隨著pH 升高而增大，在6 時(shí)達(dá)到最大值8.17 mg／g， 之后隨著pH 進(jìn)一步升高而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。 多酚以酚酸類為主， 故溶液具有一定酸性， 而pH 高低會(huì)引起多酚存在形式的變化， 即在酸性條件下有利于大孔吸附樹脂對(duì)該成分的吸附。 經(jīng)測(cè)定， 上樣液pH 為5.9， 與最大吸附效果下pH 6 相近， 故選擇不作調(diào)節(jié)的上樣液作為響應(yīng)面水平。

圖2 吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of single factor tests for absorption

2.5 解吸單因素試驗(yàn) 固定相應(yīng)因素不變， 考察解吸 液 （ 乙 醇） 體 積 流 量 （ 1、 2、 3、 4、5 mL／min）、 體積分?jǐn)?shù)（50%、 60%、 70%、 80%、90%）、 pH （4、 5、 6、 7、 8） 對(duì)解吸率的影響。

由圖3A 可知， 隨著解吸液體積流量增大， 解吸 率 逐 漸 降 低， 1 mL／min 時(shí) 為 92.14%， 而5 mL／min時(shí)僅為80.15%， 這可能是因?yàn)榻馕后w積流量較大時(shí)， 它與大孔吸附樹脂的接觸時(shí)間較短， 導(dǎo)致多酚無(wú)法從大孔吸附樹脂中充分解吸出來(lái)， 最終造成解吸率降低， 但體積流量過(guò)低會(huì)造成時(shí)間、 成本大幅上升。 由于解吸液體積流量為3 mL／min時(shí)， 解吸率仍能達(dá)到85% 以上， 故選擇其作為響應(yīng)面水平。

由圖3B 可知， 解吸液體積分?jǐn)?shù)低于70% 時(shí)，解吸率隨著其增大而提高， 在70% 時(shí)達(dá)到最大值92.51%， 但之后隨著其體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大反而減小， 在90%時(shí)僅為79.14%， 故選擇70%作為響應(yīng)面水平。

由圖3C 可知， 解吸液pH 小于6 時(shí)， 隨著其增大解吸率提高， 在6 時(shí)達(dá)到最大值93.12%； pH大于6 時(shí)， 解吸率隨著其增大反而降低， 這可能與多酚呈酸性有關(guān)， 故選擇6 作為響應(yīng)面水平。

圖3 解吸單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of single factor tests for desorption

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化 依據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)Design-Expert 軟件， 選擇上樣液體積流量（A1）、 上樣液質(zhì)量濃度（B1）、 上樣液pH （C1）作為影響因素， 吸附量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)； 選擇解吸液體積流量（A2）、 解吸液體積分?jǐn)?shù)（B2）、 解吸液pH （C2） 作為影響因素， 解吸率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。因素水平見表3。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上， 通過(guò)Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)， 結(jié)果見表4， 得到吸附量（Y1） 回歸方程為Y1＝8.17-0.025A1-0.086B1-0.34C1-0.010A1B1＋0.13A1C1＋0.077B1C1-0.14-0.25-0.93， 解吸率（Y2） 回歸方程為Y2＝92.95-2.66A2-0.81B2＋1.10C2-1.51A2B2-1.19A2C2＋2.18B2C2-8.95-4.11-3.89， 方差分析見表5。 由表可知， 吸附模型顯著 （P ＜0.05）， 準(zhǔn) 確 性 和 通 用 性 良 好 （R2＝0.937 9，＝0.858 0）， 各因素影響程度依次為上樣液pH（C1） ＞上樣液質(zhì)量濃度（B1） ＞上樣液體積流量（A1）； 解吸模型顯著（P＜0.05）， 失擬度不顯著（P＞0.05）， 準(zhǔn)確性和通用性良好（R2＝0.995 6，＝0.990 0）， 各因素影響程度依次為解吸液體積流量（A2） ＞解吸液pH （C2） ＞解吸液質(zhì)量濃度 （B2）。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

響應(yīng)面分析見圖4～5， 可知最優(yōu)吸附條件為上樣 液 體 積 流 量 2.65 mL／min， 質(zhì) 量 濃 度0.72 mg／mL， pH 5.59， 吸附量8.22 mg／g； 最優(yōu)解吸條件為解吸液體積流量2.69 mL／min， 體積分?jǐn)?shù)69.4%， pH 6.3， 解吸率93.26%。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面法結(jié)果進(jìn)行修正， 最終確定最優(yōu)吸附條件為上樣液體積流量2.6 mL／min， 質(zhì)量濃度0.7 mg／mL， pH 5.9； 最優(yōu)解吸條件為解吸液體積流量2.7 mL／min， 體積分?jǐn)?shù)69%， pH 6.3， 再進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)， 結(jié)果見表6， 可知模型擬合效果良好， 可信度高。 同時(shí)， 多酚回收率為20.37%， 其含有量由原來(lái)的7.40%提高到36.33%， 是純化前的4.9 倍。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

圖4 各因素響應(yīng)面圖（吸附）Fig.4 Response surface plots for various factors （absorption）

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.6 Results of verification tests （n＝3）

圖5 各因素響應(yīng)面圖（解吸）Fig.5 Response surface plots for various factors（desorption）

3 討論

目前， 關(guān)于多酚純化工藝優(yōu)化的研究主要是通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果， 但其難以篩選出因素最佳組合；響應(yīng)面法采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系， 通過(guò)分析回歸方程來(lái)尋找最優(yōu)工藝參數(shù)， 從而解決多變量問(wèn)題， 在提高藥用植物提取效率方面具有廣闊的應(yīng)用前景［19-20］， 故本實(shí)驗(yàn)采用該方法優(yōu)化大孔吸附樹脂純化刺梨多酚工藝。 研究表明， 多酚藥理活性與其純度密切相關(guān)［21-22］， 由于刺梨多酚在刺梨果實(shí)中的含有量較低， 提取后粗多酚中雜質(zhì)較多， 故為了加快該成分的開發(fā)利用進(jìn)程， 針對(duì)其純化研究必不可少。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 優(yōu)化后該成分純度顯著提高， 進(jìn)一步驗(yàn)證了響應(yīng)面法的優(yōu)勢(shì)。

刺梨為云貴高原特有的野生植物， 其適應(yīng)性強(qiáng)， 易栽種， 而且果實(shí)中含有大量黃酮、 維生素、多糖等成分， 具有廣闊的應(yīng)用前景。 但目前對(duì)刺梨的開發(fā)利用僅限于其果脯、 果汁， 同時(shí)刺梨多酚作為其重要有效成分， 相關(guān)研究尚處于起步階段， 尚無(wú)其提取和純化工藝報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化大孔吸附樹脂純化刺梨多酚工藝， 確定了最佳吸附、 解吸條件， 可有效提高提取物中該成分純度，為其后續(xù)藥理評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)， 也給以其為原料的化妝品、 飲料等相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供技術(shù)保障。