何 慶，劉 帥，周海霞

（德州學院 生命科學學院 功能性生物資源開發(fā)與利用省高校重點實驗室，山東 德州 253023）

胱抑素C（CysC）又稱半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，可由人體中所有的有核細胞產(chǎn)生，其基因表達速度穩(wěn)定，且無組織特異性［1］.人CysC分子量較小，能夠通過腎小球自由濾過，在近曲小管被重吸收并降解，不返回血液，而腎小管上皮細胞并不向管腔內(nèi)分泌CysC，因此CysC是目前臨床廣泛采用的一種反映腎小球濾過率變化的理想標志物［2-3］.目前國外對于人源性CysC蛋白晶體結(jié)構(gòu)以及純化手段研究較為成熟［4-5］，但國內(nèi)此類研究和報道較少，且國內(nèi)目前使用的CysC檢測試劑盒及其核心原料均由國外提供.鑒于CysC蛋白在臨床和檢驗中的重要意義，有必要對人cysC基因表達及蛋白純化、復性進行深入研究，本研究采用基因工程的方法構(gòu)建了人cysC大腸桿菌表達載體，并探討了CysC蛋白包涵體胞外復性的方法，為降低體外診斷試劑的成本，提高產(chǎn)品競爭力做出了一定的貢獻.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒：大腸桿菌E.coli DH5α、BL21菌株由本實驗室保存，原核表達載體pET32a購自TaKaRa公司.

1.1.2 試劑：BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶購自Promega公司；Taq DNA聚合酶、DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNA分子量標準和蛋白質(zhì)分子量標準購自New England Biolabs公司；D人基因組DNA提取試劑盒、細菌DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自OMEGA公司；十二烷基磺酸鈉、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）及各類抗生素購自Sigma公司；兔抗人CysC多克隆抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG、DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；人cysC基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物序列：5’-CGGGATCCTCTCCGGGTAAACCGCCG-3’，下游引物序 列 ：5’-CCCAAGCTTAGCGTCCTGGCAGGTAGA-3’；8～14ku孔徑透析袋為德國Merck產(chǎn)品.

1.1.3 儀器：PCR擴增儀、電轉(zhuǎn)化儀、核酸電泳儀、蛋白電泳儀為Bio-Rad產(chǎn)品；紫外分光光度儀為HITACHI產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體及菌株構(gòu)建：以人基因組DNA為模板克隆人cysC基因，回收純化目的片段，采用BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶對目的片段進行消化，獲得cysC基因片段.將cysC基因片段經(jīng)與BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶處理的pET32a原核表達載體通過DNA連接酶鏈接，獲得重組表達載體pET32a-cysC.使用電轉(zhuǎn)化將重組表達載體轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)菌株中，挑取平板陽性菌株進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定.同理，使用電轉(zhuǎn)化將經(jīng)鑒定的重組表達載體pET32a-cysC轉(zhuǎn)入E.coliBL21感受態(tài)菌株中，挑取陽性菌株進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定.

1.2.2 人CysC誘導表達及鑒定：將經(jīng)鑒定的重組BL21-cysC菌株接種于100ml新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期時，加入0.4mmol/L IPTG進行誘導表達，4h后10000rpm離心培養(yǎng)液，棄上清.5ml PBS緩沖溶液重懸沉淀，并進行超聲破碎，采用SDS-PAGE檢測破碎后上清和沉淀中人CysC蛋白表達情況.

1.2.3 人CysC蛋白純化及復性：擴大培養(yǎng)并收集IPTG誘導培養(yǎng)4h的重組BL21-cysC菌株，超聲破碎，通過鎳柱純化CysC蛋白包涵體及可溶性上清，采用透析法對純化產(chǎn)物進行復性，復性緩沖液1配方：20mmol/L Tris-HCl、1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5mol/L精氨酸、1.33mmol/L還原性/氧化性谷胱甘肽、0.8mol/L脲，pH=8.0；復性緩沖液2 配方：20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.02%疊氮化鈉，pH=8.0.復性溫度控制在2～8℃.

1.2.4 復性后CysC蛋白免疫反應性檢測：采用Western Blotting檢測復性后CysC蛋白免疫反應性.

2 結(jié)果

2.1 cysC基因表達載體構(gòu)建

對重組E.coli DH5α菌株質(zhì)粒采用BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶，結(jié)果陽性，證明cysC基因表達載體構(gòu)建成功.見圖1.

圖1 重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物電泳圖（通道1：pET32a-cysC；通道M：DNA分子量標準）

2.2 重組BL21-cysC菌株誘導表達情況

從圖2可以看出，沉淀和上清中均有pET32a-cysC蛋白表達，且沉淀中表達量更高，表明pET32a-cysC蛋白大部分以包涵體形式存在，小部分可溶于上清中.

圖2 IPTG誘導重組BL21-cysC菌株表達CysC蛋白（通道M：蛋白質(zhì)分子量標準；通道1：超聲破碎后沉淀物；通道2：超聲破碎后上清）

2.3 重組CysC蛋白純化和復性

采用Western Blotting檢測純化和復性后CysC蛋白，圖3中可見分子量約34kD大小的重組CysC蛋白，表明重組CysC蛋白具有一定免疫學活性.

圖3 純化后CysC蛋白檢測（通道M：蛋白質(zhì)分子量標準；通道1：CysC蛋白純化產(chǎn)物）

圖4 復性CysC蛋白Western Blotting分析

3 討論

表達載體對基因表達和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其活性具有很大的影響，并能影響蛋白質(zhì)純化及復性［6］.本研究采用pET32a作為cysC基因表達載體，采用IPTG誘導cysC表達，我們發(fā)現(xiàn)重組CysC在pET32a中盡管大多數(shù)為包涵體形式，但有部分以可溶性形式存在，這與李江峰等［7］報道CysC在pET28a、pCold1等表達載體中均已包涵體形式存在有差異.這種差異的實際益處在于可溶性重組CysC的后續(xù)純化和復性操作更為簡單.重組CysC蛋白包涵體形成至少與兩方面原因有關(guān)，一是CysC蛋白中存在兩個二硫鍵和較為復雜的β-片層結(jié)構(gòu)，真核生物蛋白在原核表達載體中表達及修飾過程中難以進行正確折疊，造成疏水基團暴露［8］；二是與表達載體使用的蛋白質(zhì)標簽所具有的的功能有關(guān)，本研究采用的pET32a中使用的是His標簽，分子量較小，有利于目標蛋白的純化、分析，對其折疊并不會造成太大的影響，有助于在復性過程中獲得具有更高生物活性的蛋白［9］.

包涵體復性的目的是獲取有生物學活性的蛋白，是極為關(guān)鍵的步驟.本研究在復性緩沖液體系中引入還原性/氧化性谷胱甘肽的目的在于促進重組CysC蛋白形成正確的的二硫鍵，在其他蛋白表達時可根據(jù)特定蛋白二硫鍵數(shù)量適當調(diào)整還原性和氧化性谷胱甘肽的比例［10］.精氨酸能夠避免復性中重組CysC蛋白相互聚集，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用.本研究通過Western Blotting檢測分析復性CysC蛋白的免疫學活性，結(jié)果顯示有部分重組蛋白表現(xiàn)出免疫學活性.提示本研究所采用的復性方法能夠一定程度地恢復重組蛋白質(zhì)的生物學活性.

綜上，本研究成功構(gòu)建大腸桿菌cysC表達重組工程菌，經(jīng)純化、復性得到的重組CysC蛋白具有一定免疫活性，為今后cysC基因原核表達和復性提供了一定借鑒，在一定程度上為今后CysC的生產(chǎn)和臨床應用提供了一定方法學基礎(chǔ).