王國莉,陳兆貴,張銀枚,2,龔冠平,3文佩玲
(1.惠州學院生命科學學院,廣東惠州516007;2.華南師范大學生命科學學院,廣東廣州516031;3.暨南大學生命科學學院,廣東廣州516032)
植物對零度以上低溫的耐受能力、適應和抵御能力稱為植物的抗冷性[1].馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是全球第四大糧食作物[2],生長季節(jié)短,最適生長溫度為13~21℃[3],低溫冷害不僅抑制植株生長,還引起代謝紊亂,植株萎蔫甚至死亡,嚴重影響馬鈴薯的產量和品質[4].在我國南方,冬種馬鈴薯的播種期為10月至11月,次年2月至3月收獲[3],這期間低溫甚至霜凍會對馬鈴薯生產造成極大影響,如2010年廣東惠東霜凍,馬鈴薯受災面積0.34萬hm2,直接經濟損失高達2026萬元[5].因此生產上選擇適宜的抗寒誘導劑來提高馬鈴薯的低溫抗性,具有重要意義.脫落酸(Abscisic aicd,ABA)作為一種逆境激素[6],是從眾多抗寒誘導劑中篩選出的、作用效果最好的[7-9].研究證實外源ABA能提高油菜[10]、甜椒[11]、草莓[12]等植物的抗冷性,主要是通過提高植株的光合速率、降低質膜的過氧化作用、提高抗氧化酶活性等來實現的.在植物細胞生長和分化過程中,多胺有著極為重要的調節(jié)作用.在冷害條件下,多胺生成酶發(fā)揮作用,與細胞膜的磷脂部位相結合抵抗逆境,保護植物,防止細胞溶質外滲,從而提高植物抗冷性.用亞精胺(Spermidine,Spd)或精胺處理,可以提高冷脅迫下玉米種子[13]、辣椒幼苗[14]以及茄子種子和幼苗的抗冷性[15].油菜素內酯(Brassinolide,BR)是一種天然植物激素,被稱為第六激素[16],廣泛存在于植物的各個器官中[16].植物經過低濃度 10-5~10-6mg·L-1處理便能表現出明顯的生理效應,能提高植物對低溫的抗性[17].外源BR可以提高玉米幼苗的抗冷性[18],增加長鞭紅景天耐低溫的能力[19],誘導番茄幼苗的抗冷性[20],作用方式可能是通過避免植物幼苗生成過量的自由基,或者是通過誘導形成自由基清除劑來減輕膜脂過氧化作用的程度,以此來穩(wěn)定膜的結構與功能,加強膜的抵御能力,從而使植物適應低溫逆境的變化[21].本研究采用不同濃度的脫落酸、亞精胺和油菜素內酯處理馬鈴薯苗,通過模擬低溫冷害條件,篩選誘導馬鈴薯抗冷性的最適濃度,以期在生產中推廣應用并提高馬鈴薯的種植效益.
試驗所用馬鈴薯薯種購自惠州冬種馬鈴薯生產基地,品種為費烏瑞它,切塊后在實驗室外置于育苗盒中培育5周,至株高10~16 cm時,選取3組長勢一致、健康生長的馬鈴薯苗進行處理.第1組63株,分成7組,每組9株,5個處理組分別噴施100 mL 的5、10、15、20、25 mg·L-1的ABA溶液,2個對照組噴施蒸餾水.第2組54株,分成6組,每組9株,4個處理組分別噴施100 mL 0.01、0.1、0.5和1 mmol·L-1的亞精胺溶液,2個對照組噴施蒸餾水.第3組54株,分成6組,每組9株,4個處理組分別噴施100 mL 0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1的BR溶液,2個對照組噴施蒸餾水.
噴施時添加吐溫80,葉片上下表面均勻噴灑,直至葉緣有水珠滴下,之后在常溫下放置30 min,待葉片完全晾干后,將處理和低溫對照(CK2)放置于提前設定好參數的人工氣候培養(yǎng)箱,溫度為10℃,光照強度2400 lx,相對濕度80%,每天光照12 h.常溫對照(CK1)在溫度20℃,光照強度2400 lx,相對濕度80%的人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng),每天光照12 h.處理72 h后,從培養(yǎng)箱取出馬鈴薯植株,立即測定其生理生化指標.
低溫處理開始后,每天定時觀察和記錄馬鈴薯植株的冷害狀況,并對冷害癥狀進行分級.0級:馬鈴薯葉片正常,未受傷害;1級:僅少數馬鈴薯葉片邊緣有輕度的皺縮萎蔫,部分葉片變軟;2級:半數以下的葉片萎蔫,但主莖未死,復燃后仍能存活;3級:半數以上的葉片萎蔫死亡;4級:整株植株死亡[22]。
葉綠素含量的測定參照張志良[23]的方法;可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G250染色法[23];可溶性總糖含量的測定采用蒽酮比色法[23];相對電導率的測定參照陳愛葵[24]的方法;丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥法[23];超氧化物歧化酶活性的測定采用氮藍四唑法[23];過氧化物酶活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[23].每個處理重復測定三次,取平均值.
實驗數據采用SPSS19.0軟件進行統計分析,采用鄧肯新復極差法進行多重比較,小寫英文字母表示差異顯著水平.用Excel 2013作圖.
由表1可知,未經ABA處理的馬鈴薯苗(CK2)低溫下有植株發(fā)生萎蔫,少數葉片變軟蜷縮,葉尖變成褐色,冷害等級為2級,冷害指數最高,達16.67%.10和15 mg·L-1ABA處理的植株生長良好,未表現出明顯冷害癥狀,冷害等級為0級,冷害指數為0.經5、20和25 mg·L-1ABA處理的個別植株發(fā)生萎蔫,少數葉片變軟并且蜷縮,冷害等級為1級,冷害指數分別是8.33%、5.56%和5.56%.
未經SPD處理的馬鈴薯苗(CK2)低溫脅迫下有些植株發(fā)生萎蔫,冷害等級為2級,冷害指數達到22.22%.經0.01、0.1和1 mmol·L-1Spd處理的馬鈴薯苗僅個別植株的葉片萎蔫變軟,冷害等級1級,冷害指數分別為11.11%、5.56% 和2.78%.0.5 mmol·L-1Spd處理的馬鈴薯苗葉片,生長狀況良好,冷害等級0級,冷害指數為0.
未經BR處理的馬鈴薯苗(CK2)低溫脅迫下有60%的植株葉片完全萎蔫,其余葉片也有輕微凍傷,冷害級別3級,冷害指數5.42%.但經不同濃度BR處理的馬鈴薯苗冷害癥狀減輕,0.01 mg·L-1BR處理的馬鈴薯苗生長狀況良好,葉片飽滿,葉面有光澤,植株健壯,冷害0級,冷害指數為0;經1 mg·L-1的BR處理的馬鈴薯苗整體生長狀況良好,僅個別的葉片萎蔫和變軟,冷害1級,冷害指數為1.25%;經過0.001 mg·L-1和0.1 mg·L-1的BR處理的馬鈴薯苗有50%的葉片萎蔫和輕微的凍傷,冷害2級,冷害指數為2.92%.
表1 馬鈴薯植株的冷害程度
從圖1可知,未經ABA處理的馬鈴薯苗(CK2)低溫下葉綠素含量與CK1比較顯著下降28.04%,經5、10、15、20、25 mg·L-1ABA處理的葉綠素含量低溫下呈現先升高后降低的趨勢,分別較低溫對照顯著增加27.64%、42.22%、32.10%、26.89%和19.86%,以10 mg·L-1處理的葉綠素含量最高,與其它處理比較差異顯著.
未經SPD處理的馬鈴薯苗(CK2)低溫脅迫下葉片的葉綠素含量與CK1比較顯著下降36.46%,經Spd處理的馬鈴薯苗低溫下較對照的葉綠素含量顯著增加,0.5 mmol·L-1處理的葉綠素含量最高,較低溫對照增加68.33%,0.01、0.1和1.0 mmol·L-1處理則分別增加12.75%、45.98%和42.03%.
未經BR處理的馬鈴薯苗(CK2)低溫脅迫下葉片的葉綠素含量顯著下降,0.01、0.1和1 mg·L-1BR處理的葉綠素含量與常溫對照比沒有顯著差異,0.01 mg·L-1BR處理的葉綠素含量最高,較低溫對照顯著增加50.20%.0.001 mg·L-1處理的葉綠素含量顯著高于低溫對照,但葉綠素含量較其它3個處理顯著降低.這說明采用BR處理可以有效減緩低溫下馬鈴薯苗葉綠素的降解速度.
圖1 不同處理對馬鈴薯苗葉片葉綠素含量的影響
從圖2可以看出,低溫脅迫下馬鈴薯的對照及經5、15、20、25 mg·L-1ABA處理的可溶性蛋白含量與常溫對照比沒有顯著差異,10 mg·L-1ABA處理的可溶性蛋白含量較低溫對照顯著增加16.06%,其含量也顯著高于常溫對照和其它處理.
低溫下未經Spd處理的馬鈴薯葉片可溶性蛋白含量較常溫對照顯著降低10.18%,Spd處理的可溶性蛋白含量較低溫對照顯著增加,0.5 mmol·L-1Spd處理的可溶性蛋白含量最高.經0.01、0.1和1.0 mmol·L-1處理的可溶性蛋白含量較低溫對照分別增加9.54%、19.26%和21.44%.
未經BR處理的馬鈴薯苗(CK2)低溫脅迫下的可溶性蛋白含量較常溫對照和其它處理都顯著下降,0.01 mg·L-1BR處理的可溶性蛋白含量顯著高于低溫和常溫對照,比低溫對照增加20.48%,0.001、0.1和1.0 mg·L-1BR處理的可溶性蛋白含量則分別比低溫對照顯著增加9.55%,12.99%和9.05%.
圖2 不同處理對馬鈴薯苗葉片可溶性蛋白含量的影響
從圖3可知,低溫下未經ABA處理的馬鈴薯葉片內可溶性總糖含量較常溫對照顯著下降28.49%,經5、10、15、20、25 mg·L-1ABA處理的可溶性總糖含量呈先升后降趨勢,分別較低溫對照顯著增加26.38%、33.63%、32.58%、22.59%、15.13%.以10 mg·L-1ABA處理的可溶性總糖含量最高,與常溫對照相比差異不顯著.
低溫脅迫時,未經Spd處理的馬鈴薯苗(CK2)葉片的可溶性總糖含量較常溫對照顯著降低28.89%,采用Spd處理可以顯著增加葉片的可溶性總糖含量,以0.5 mmol·L-1Spd處理的可溶性總糖含量最高,較低溫對照顯著增加96.56%,并顯著高于常溫對照.經0.01、0.1和1.0 mmol·L-1Spd處理的可溶性總糖含量則分別增加35.97%、76.94%和53.18%.
低溫下未經BR處理的馬鈴薯苗(CK2)葉片的可溶性總糖含量較常溫生長的植株顯著下降,但BR處理可顯著增加可溶性總糖的含量,與低溫對照比較,采用0.001、0.01、0.1和1.0 mg·L-1BR處理的可溶性總糖含量分別增加19.58%、44.9%、37.75%和35.48%,以0.01 mg·L-1BR處理的可溶性總糖含量最高,并顯著高于常溫對照.
圖3 不同處理對馬鈴薯苗葉片可溶性總糖含量的影響
由圖4可知,與常溫對照相比,低溫下未經ABA處理的馬鈴薯(CK2)葉片的相對電導率顯著增加273.76%,采用5、10、15、20、25 mg·L-1ABA處理的相對電導率較低溫對照顯著下降52.44%、71.18%、70.54%、54.4%、30.92%,其中10 mg·L-1和15 mg·L-1ABA處理的相對電導率接近,顯著低于其它處理,與常溫對照比差異不顯著.
低溫脅迫下所有馬鈴薯葉片的相對電導率顯著增加,未經Spd處理的馬鈴薯(CK2)葉片的相對電導率比常溫對照顯著增加85.72%,Spd處理的相對電導率較低溫對照顯著下降,以0.1和0.5 mmol·L-1處理的相對電導率最低,比低溫對照下降37.15%和37.89%,0.01和1.0 mmol·L-1處理的相對電導率比低溫對照低11.84%和26.67%.
低溫下未經BR處理的馬鈴薯(CK2)葉片的相對電導率較常溫對照顯著增加,采用0.001、0.01、0.1和1.0 mg·L-1BR處理的相對電導率較低溫和常溫對照顯著下降,分別較低溫對照下降25.12%、78.26%、31.95%和20.00%,以0.01 mg·L-1BR處理的相對電導率最低.由此說明,低溫脅迫時BR處理可以有效減輕馬鈴薯葉片細胞膜的損傷程度,減少細胞電解質向外滲漏,增加其抗冷性.
圖4 不同處理對馬鈴薯苗葉片相對電導率的影響
從圖5可知,低溫脅迫使馬鈴薯苗葉片的丙二醛含量與常溫對照相比顯著增加,未經ABA處理的低溫對照的丙二醛含量增加64.25%.經過5、10、20 mg·L-1ABA處理的丙二醛含量分別較低溫對照顯著下降20.18%、30.32%、12.23%,以10 mg·L-1ABA處理的丙二醛含量下降最多,與其他處理相比差異顯著.15和25 mg·L-1ABA處理的丙二醛含量與低溫對照相比差異不顯著.
低溫脅迫下,低溫對照、0.01、0.1和1.0 mg·L-1Spd處理的馬鈴薯苗葉片的丙二醛含量顯著高于常溫對照,低溫對照的丙二醛含量最高,較常溫對照顯著增加23.96%.0.01、0.1和0.5 mmol·L-1Spd處理的丙二醛含量較低溫對照顯著下降,以0.5 mmol·L-1處理的丙二醛含量最低,比低溫對照顯著下降27.25%,0.01和0.1 mmol·L-1處理的丙二醛含量則分別降低7.07%和14.54%,1.0 mg·L-1Spd處理的丙二醛含量與低溫對照比差異不顯著.
在BR處理試驗中,低溫對照的馬鈴薯苗葉片中丙二醛含量較常溫對照顯著增加,但經BR處理的丙二醛的含量較低溫對照顯著下降.0.001、0.01、0.1和1.0 mg·L-1BR處理的丙二醛含量分別較低溫對照下降13.53%、45.81%、19.40%和23.39%,以0.01 mg·L-1處理的植株葉片丙二醛含量最低,其它處理與常溫對照比差異不顯著.這說明在低溫脅迫下BR處理的馬鈴薯苗可以有效減緩丙二醛的生成,保護細胞膜的完整性,減輕馬鈴薯苗低溫傷害程度,增強其抗冷性.
圖5 不同處理對馬鈴薯苗葉片丙二醛含量的影響
從圖6可以看出,與常溫對照相比,未經ABA處理的馬鈴薯苗(CK2)的SOD活性顯著下降41.35%,經5、10、15、20、25 mg·L-1ABA處理的SOD活性較低溫對照顯著增加63.97%、92.46%、54.62%、59.77%、55.09%,10 mg·L-1ABA處理的SOD活性顯著高于對照和其它處理.
低溫脅迫下,未經Spd處理的馬鈴薯(CK2)葉片的SOD活性較常溫對照顯著降低28.99%,所有Spd處理的SOD活性都顯著高于低溫對照,0.5 mmol·L-1Spd處理的SOD活性最高,較低溫對照顯著增加57.14%,并高于常溫對照;0.01、0.1和 1.0 mmol·L-1Spd處理的SOD活性較低溫對照顯著增加28.16%、39.93%和26.91%.
低溫下未經BR處理的馬鈴薯(CK2)葉片的SOD活性比常溫對照顯著下降41.34%,BR處理能顯著增加馬鈴薯葉片的SOD活性,0.01和1 mg·L-1BR處理的SOD活性顯著高于對照和其它處理,0.01 mg·L-1BR處理的酶活性最高,較低溫對照顯著增加69.77%,0.001、0.1和1.0 mg·L-1BR處理的酶活性則分別增加45.67%、37.08%和37.67%.
圖6 不同處理對馬鈴薯苗葉片SOD活性的影響
從圖7可以看出,低溫脅迫下,未經ABA處理的馬鈴薯(CK2)的POD活性較常溫對照顯著下降50.48%,經5、10、20 mg·L-1ABA處理的POD活性顯著增加,高于低溫對照98.08%、99.04%、28.17%,且5 mg·L-1和10 mg·L-1ABA處理的POD活性與常溫對照比差異不顯著,10 mg·L-1ABA處理的POD活性最高.
低溫下未經Spd處理的馬鈴薯(CK2)的POD活性較常溫對照顯著下降28.07%,經Spd處理的所有馬鈴薯的POD活性顯著增加,以0.5 mmol·L-1處理的POD活性最高,比低溫對照增加96.49%,0.01、0.1和1.0 mmol·L-1Spd處理的POD活性分別增加31.58%、87.72% 和40.35%,0.1、0.5和1.0 mmol·L-1Spd處理的POD活性亦顯著高于常溫對照.
與常溫對照相比,低溫下未經BR處理的馬鈴薯葉片的POD活性顯著下降107.95%.BR處理能顯著增加低溫脅迫下馬鈴薯葉片的POD活性,0.01 mg·L-1BR處理的POD活性最高,較低溫對照顯著增加97.95%,0.001、0.1和1.0 mg·L-1BR處理的酶活性分別增加68.24%,84.62% 和85.57%.0.01、0.1和1.0 mg·L-1BR處理的酶活性與常溫對照比差異不顯著.
圖7 不同處理對馬鈴薯苗葉片POD活性的影響
低溫是影響馬鈴薯生長和產量的重要環(huán)境因素[25].廣東是我國南方冬種馬鈴薯的主要產區(qū),惠州地區(qū)種植范圍非常廣泛.現如今惠州已經建成兩個冬種馬鈴薯的國家級萬畝高產示范區(qū)[26],種植面積已達1萬hm2[27].但鑒于惠州整個冬季氣溫比較低,歷年冬季平均溫度均在14.5℃左右[28],因此研究馬鈴薯的低溫抗冷性并選擇適宜抗寒誘導劑極具現實意義.
低溫下植物體內生理生化指標的變化可以較好地反映植物的耐冷性情況.葉綠素是植物進行光合作用、促進有機物合成,為植物生長發(fā)育提供能量的重要保障[10,29].低溫下植物體內親水性的可溶性蛋白含量增加,可以降低細胞水勢阻止細胞過度失水,還可參與植物基因的表達,促進抗凍性蛋白的合成[30].可溶性總糖在低溫逆境下可通過降低植物細胞的水勢和穩(wěn)定細胞膜大分子的結構,來降低低溫對植物細胞的傷害[31].因此在低溫脅迫時,植物體內葉綠素、可溶性蛋白和可溶性總糖的含量越高,植物的低溫耐性越強.相對電導率和丙二醛的含量都能夠反映植物細胞膜的受損傷程度[32].低溫下植物相對電導率增加是因為細胞膜的選擇透過能力下降,導致細胞內含物外滲引起的[33];丙二醛是植物發(fā)生脂膜過氧化作用的產物,含量越高說明細胞膜受到的傷害越嚴重[34].SOD和POD都能夠催化植物體內活性氧(·O2-、·OH-、H2O2)轉化生成H2O和O2,減少氧自由基的傷害,增強植物的低溫耐性[16,35].同等條件下,SOD和POD活性越高,植物的抗冷性越強.
我們發(fā)現,與常溫對照相比,低溫脅迫下馬鈴薯葉片的葉綠素含量、可溶性蛋白含量、可溶性總糖含量均顯著下降,相對電導率和丙二醛的含量顯著升高,SOD和POD活性顯著下降,說明低溫對馬鈴薯造成的傷害比較嚴重,表現為葉片變軟、蜷縮,葉尖變成褐色,受冷害嚴重的植株直接萎蔫等[37].
ABA作為一種逆境激素,在植物遭遇寒冷、干旱等逆境條件時體內ABA含量都會增高.王慧等[7]已經從眾多抗寒誘導劑中篩選出脫落酸為作用效果最好的抗寒誘導劑[8-9].研究證實脫落酸能夠緩解葉綠素的降解,提高油菜的光合速率[10];通過提高甜椒葉片的可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調節(jié)物質的含量,增強甜椒幼苗的抗冷性[11];能夠顯著降低草莓的丙二醛含量和電導率[12],減輕膜脂的過氧化作用;亦可通過提高香蕉幼苗冷脅迫期間超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的活性,緩解低溫對香蕉幼苗的傷害程度[22].
在植物細胞生長和分化過程中,多胺有著極為重要的調節(jié)作用.在冷害逆境條件下,多胺生成酶發(fā)揮作用,與細胞膜的磷脂部位相結合抵抗逆境,保護植物,防止細胞溶質外滲,從而提高植物抗冷性.曹玉杰[36]用尸胺處理降低了黃瓜幼苗電解質滲透率和丙二醛含量,提高了可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量,SOD、POD和過氧化氫酶(CAT)活性顯著上升,提高了黃瓜幼苗的抗冷性.鄭昀曄等[13]發(fā)現亞精胺和精胺可在冷脅迫情況下提高玉米種子CAT、SOD、POD活性,提高發(fā)芽率,縮短發(fā)芽時間.張帆[14]等發(fā)現亞精胺能提高辣椒幼苗葉綠素、脯氨酸含量,降低丙二醛含量,增強辣椒幼苗的抗冷性,降低死亡率.張彥萍[15]等發(fā)現用0.25 mmol·L-1的亞精胺和精胺處理‘豐研2號’茄子種子,可顯著提高種子在低溫脅迫條件下的活力,提高茄子幼苗的抗氧化酶活性和脯氨酸含量,顯著降低幼苗細胞質膜透性和丙二醛含量.
BR是一種天然植物激素,被稱為第六激素,廣泛存在于植物的各個器官中[16].雖然在植物體內BR含量極低,但其生理活性卻非常高,植物經過低濃度10-5-10-6mg·L-1處理便能表現出明顯的生理效應,能提高植物對低溫的抗性[17].BR對植物的作用方式可能是通過避免植物幼苗生成過量的自由基,或者是通過誘導形成自由基清除劑來減輕膜脂過氧化作用的程度,以此來穩(wěn)定膜的結構與功能,加強膜的抵御能力,從而使植物適應低溫逆境的變化[21].閆慧萍[18]等發(fā)現BR處理能提高可溶性糖和可溶性蛋白含量,從而提高玉米幼苗的抗冷性;馬令法[19]等發(fā)現BR處理能提高POD活性和SOD活性,從而增強栽培長鞭紅景天耐低溫脅迫的能力;袁凌云[20]等研究發(fā)現BR處理能有效的減緩丙二醛積累和降低相對電導率,從而能提高番茄幼苗的抗冷性.
但經ABA、Spd、BR處理后,與低溫對照比較,馬鈴薯葉片的葉綠素含量、可溶性蛋白含量、可溶性總糖含量增加,相對電導率和丙二醛的含量下降,SOD和POD活性亦升高.尤其是采用10 mg·L-1和15mg·L-1ABA處理、0.5 mmol·L-1Spd處理以及0.01 mg·L-1BR處理的冷害指數均為0,各生理和生化指標均顯著優(yōu)于對照和其它處理,這為生產上使用適宜濃度抗寒誘導劑來提高馬鈴薯的低溫耐性提供了理論支持.
由于脫落酸溶液見光易分解,建議在霜凍前一天早晨或者傍晚光線較弱的時候施用.而亞精胺屬于低毒性芳香胺類化合物,可引起輕微皮膚刺激和過敏反應,使用時須穿戴必要的防護用具并站上風位置.