沈煜宸 曹毅 陶茂燦

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310053)

近幾年來，由于臨床診治時濫用抗生素、糖皮質(zhì)激素等藥物，導(dǎo)致各種真菌對抗真菌藥物的耐藥性日漸增強，后續(xù)治療可供選擇藥物愈來愈少，這類真菌感染性問題的解決迫在眉睫。臨床上經(jīng)常使用的抗真菌藥物主要有氟康唑、伏立康唑、酮康唑等。其中氟康唑常被選作治療真菌感染的藥物，但長期使用，不但會導(dǎo)致耐藥性大大增加，而且在耐受氟康唑類藥物后真菌也會對其他抗真菌藥物產(chǎn)生一系列交叉耐藥性[1]。因此，目前有許多中藥研究是在與氟康唑類藥物協(xié)同作用的基礎(chǔ)上進行抗耐藥試驗的[2-5]。

1 白念珠菌生物膜耐藥機制的研究現(xiàn)狀

白念珠菌生物膜是由大量菌絲相細胞、少量酵母相細胞以及由菌體分泌的基質(zhì)共同組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[6]。白念珠菌生物膜以一種屏障形式導(dǎo)致了真菌耐藥。生物膜包被下的白念珠菌與懸浮狀態(tài)下的白念珠菌相比，前者感染后導(dǎo)致的臨床疾病治療上更棘手，預(yù)后情況也更差[7]。因此，研究白念珠菌生物膜的耐藥機制對于治療其引起的感染很有意義。

目前，對白念珠菌生物膜耐藥機制的研究主要包括細胞密度、藥物外排泵的上調(diào)、法尼醇的影響、細胞外基質(zhì)等因素的影響[8]。

1.1 細胞密度

目前已有研究表明細胞密度是影響白念珠菌生物膜耐藥性的一個重要因素，高細胞密度可以使白念珠菌生物膜的最低抑菌濃度(MIC)升高。

Perumal等[9]實驗研究了細胞密度對白念珠菌耐藥性的影響，在測試了不同的唑類藥物后，證明了高細胞密度可明顯提高白念珠菌生物膜的最低抑菌濃度。Seneviratne等[10]也通過試驗證實高細胞密度能升高白念珠菌生物膜對嘧啶類似物和酮康唑的最低抑菌濃度。

1.2 藥物外排泵的上調(diào)

白念珠菌生物膜耐藥性與多重耐藥性轉(zhuǎn)運基因和多重編碼的表達有關(guān)，藥物外排泵的上調(diào)已被證實為使白念珠菌生物膜耐藥性的升高因素之一[11]。

在多重耐藥性轉(zhuǎn)運體的基因中，未成熟白念珠菌生物膜中的MDR1、CDR1和CDR2會在耐氟康唑類藥物環(huán)境下表達水平更高，而在成熟白念珠菌生物膜內(nèi)敲除上述單個基因或聯(lián)合敲除2個或以上基因，高水平的耐藥性不會受到任何影響[12]。卜興勝[13]等測定221名被白念珠菌感染患者的中段尿、痰、糞便、咽拭子中氟康唑最低抑菌濃度(MIC)后發(fā)現(xiàn)，耐藥組中CDR1和CDR2的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯高于敏感組。研究表明使用氟康唑類藥物更易使白念珠菌產(chǎn)生耐藥性。

1.3 法尼醇的影響

法尼醇是白念珠菌分泌一種的化學(xué)信號分子，可以通過生物膜的構(gòu)建和生物膜細胞的離散來影響白念珠菌生物膜的形成[14]。最近Yu等[15]發(fā)現(xiàn)，法尼醇抑制了麥角甾醇合成途徑中的基因表達，從而減弱白念珠菌對氟康唑的耐藥性。許雯倩等[16]試驗表明白念珠菌生物膜中的麥角甾醇含量與耐藥性呈正相關(guān)。法尼醇能降低白念珠菌生物膜中麥角甾醇含量，通過破壞細胞膜的穩(wěn)定性改變其對氟康唑類藥的通透性，達到抑制耐藥性的作用。

1.4 細胞外基質(zhì)

與細菌生物膜相類似，白念珠菌的生物膜細胞外基質(zhì)在維持整個白念珠菌生物膜耐藥性以及結(jié)構(gòu)的完整性等方面有著相當(dāng)顯著的作用[17]，β-1,3-葡聚糖是白念珠菌生物膜的主要成分之一，其可以阻止藥物滲入，使真菌耐藥[18-21]。

1.5 其他機制的研究

藥物作用靶酶表達變異，應(yīng)激狀態(tài)下的鈣調(diào)磷酸酶活性上調(diào)等都可能與白念珠菌生物膜耐藥性有關(guān)[22]。多胺可使細胞內(nèi)活性氧的含量下降，從而導(dǎo)致白念珠菌生物膜形成能力加強而產(chǎn)生耐藥性[23]。宿主免疫狀態(tài)、基礎(chǔ)疾病、營養(yǎng)狀態(tài)、菌株生長速度、基因表達都與白念珠菌耐藥密切相關(guān)。

2 中藥與白念珠菌生物膜的研究

目前中醫(yī)藥治療白念珠菌的感染的研究已經(jīng)大量開展，主要通過研究中藥中有效成分、中藥復(fù)方等方面來探討抗白念珠菌生物膜的問題。

2.1 中藥中有效成分的研究

目前有數(shù)百種中藥已被證實具有抑制真菌的作用，但只有少數(shù)中藥被研究出具有抗白念珠菌生物膜的作用，有不少研究表明這些少數(shù)中藥中的有效成分對白念珠菌生物膜作用有抑制作用。穿心蓮具有抗病毒、抗腫瘤、抗真菌等作用，而穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮主要成分之一[24]。施高翔等[25]發(fā)現(xiàn)白念珠菌生物膜內(nèi)的細胞核在10 mol/L、100 mol/L、1000 mol/L穿心蓮內(nèi)酯濃度下都發(fā)生了縮小，并且其線粒體的性質(zhì)發(fā)生改變，細胞內(nèi)活性氧含量升高。赤芍具有抗腫瘤、降血糖、抗血栓等作用，赤芍苷是赤芍的主要成分之一[26]。王殿明等[27]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著赤芍苷濃度的升高，白念珠菌生物膜中死菌數(shù)升高，黏附率下降。在赤芍苷濃度為4 g/L時，其抑制白念珠菌生物膜的形成率超過90%。苦參具有利尿、抗病毒、抗腫瘤等作用，苦參堿是其主要成分。汪長中等[28]觀察在不同濃度苦參堿濃度下的白念珠菌生物膜，發(fā)現(xiàn)在1.0 mg/mL時白念珠菌生物膜只存在少數(shù)酵母細胞，沒有菌絲生成；0.1 mg/mL時白念珠菌生物膜可見菌絲及沿著菌絲分布的酵母細胞；0.01 mg/mL時菌絲及酵母細胞大量分布。實驗提示苦參堿可以限制白念珠菌生物膜形成。

我科也對中藥中有效成分抗白念珠菌生物膜做了研究。ALS1、ALS2、ALS3是白念珠菌細胞壁中大分子糖蛋白ALS基因家族中具有代表性的黏附相關(guān)基因。談潘莉[29]等實驗發(fā)現(xiàn)黃根醇提取物可抑制ALS2、ALS3基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致生物膜無法正常形成。

2.2 復(fù)方制劑的研究

目前大多數(shù)試驗研究集中在單味中藥或是其單一提取物上，而中草藥在臨床運用上大多數(shù)是復(fù)方制劑，復(fù)方中多種復(fù)合成分作用于人體，故研究復(fù)方中藥制劑比單味藥研究更為重要。麥角甾醇能使白念珠菌生物膜更穩(wěn)定，維持白念珠菌的致病能力。嚴(yán)園園等[30]研究黃連解毒湯乙酸乙酯提取物聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ぶ宣溄晴薮己康挠绊?，結(jié)果顯示單用黃連解毒湯乙酸乙酯提取物或氟康唑的用藥組白念珠菌生物膜中麥角甾醇含量下降程度較小，而聯(lián)合用藥組的麥角甾醇含量明顯下降；實驗發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯乙酸乙酯提取物聯(lián)合氟康唑用藥能使白念珠菌生物膜受到損傷，從而達到抗生物膜的效應(yīng)。官妍等[31]研究自制中草藥復(fù)方制劑(成分：苦參10g，百部30g，野菊花30g，蛇床子50g，土槿皮30g，公丁香10g，黃柏50g，藥物濃度調(diào)制1 g/mL生藥)對白念珠菌體外形成生物膜的影響，實驗發(fā)現(xiàn)該中藥復(fù)方對白念珠菌生物膜SMIC50及SMIC80分別為3.255 mg/mL、6.51 mg/mL，證明該中藥復(fù)方能抑制白念珠菌生物膜形成。劉濤峰等[32]設(shè)立對照組比較復(fù)合苦參、土槿皮、黃柏、百部、黃連、虎杖、黃芩、大黃、藿香、五倍子中藥混合液及以上單味藥對抗白念珠菌生物膜的作用，實驗得出該復(fù)方混合液能明顯抑制白念珠菌生物膜形成，且作用效果遠遠高于單味藥。

3 中藥影響白念珠菌生物膜的機制

目前抑制白念珠菌生物膜的傳統(tǒng)中藥，就其作用機制，主要有以下3方面：一是影響白念珠菌細胞黏附能力；二是改變白念珠菌生物膜形態(tài)；三是使白念珠菌生物膜細胞凋亡及分散[33]。田玉珠等[34]研究厚樸有效成分和厚樸酚對白念珠菌生物膜的影響，實驗發(fā)現(xiàn)白念珠菌生物膜在和厚樸酚作用下死菌數(shù)增加，生物膜厚度下降；在1000 μg/mL濃度內(nèi)，和厚樸酚濃度與白念珠菌黏附作用呈負相關(guān)。李水秀等[35]探討漢防己甲素對氟康唑?qū)Π啄钪榫锬さ膮f(xié)同作用，實驗發(fā)現(xiàn)漢防己甲素在體外對氟康唑抗白念珠菌生物膜早期有增效作用，而藥物外排泵基因MDR1、CDR1和CDR2可能是使其有增效作用的原因[36]，漢防己甲素在體外能下調(diào)藥物外排泵基因的mRNA表達，使藥物泵出減少，細胞內(nèi)藥物聚積，從而逆轉(zhuǎn)細胞的耐藥。

談潘莉等[37]評價白鮮皮的有效成分白鮮堿對白念珠菌生物膜形成及細胞黏附能力的影響，并且實時熒光定量PT-PCR檢測白鮮堿作用后ALS3基因表達情況。實驗得出白鮮堿對白念珠菌生物膜SMIC50及SMIC80分別為256 μg/mL和512 μg/mL；白鮮堿作用后ALS3轉(zhuǎn)錄水平下降。我科課題組近來開展黃連解毒湯治療白念珠菌感染的研究。課題組采用新一代高通量測序技術(shù)、特異性熒光定量PCR法測定黃連解毒湯處理后白念珠菌轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵因子[38]，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析了黃連解毒湯處理前后白念珠菌的基因表達變化，發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯參與了包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)運蛋白活性在內(nèi)的26個信號通路，其作用機制可能是通過特定信號途徑調(diào)控白念珠菌若干基因及其轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄和表達，從而有利于提升三唑類藥物的抗菌效果[39]。綜上我們推測黃連解毒湯的抑菌作用是同時作用于白念珠菌的多個信號途徑，它的關(guān)鍵基因及作用模式存在多樣性，這些實驗結(jié)果為黃連解毒湯對體外白念珠菌生物膜形成的影響研究提供了新的參考。

4 小 結(jié)

隨著醫(yī)學(xué)水平的提高、醫(yī)療環(huán)境的變化，白念珠菌耐藥性問題也日益突出，許多研究表明白念珠菌生物膜耐藥機制的研究主要包括細胞密度，藥物外排泵的上調(diào)，法尼醇的影響，細胞外基質(zhì)等因素。而中藥制劑具有來源廣、抗耐藥性好等特點，目前針對中醫(yī)藥治療白念珠菌感染的研究已經(jīng)積極開展。但目前大部分具有抑菌作用的中藥是否對白念珠菌生物膜有抑制作用尚不明確，僅有少數(shù)中藥已研究表明能抗白念珠菌生物膜。同時，目前大多數(shù)對白念珠菌生物膜的研究是體外實驗，還沒有涉及體內(nèi)環(huán)境的研究，白念珠菌生物膜的耐藥機制還需要更多研究，而探索更多抗白念珠菌生物膜形成的中藥也是研究重點。