許達峰，周開倫，李灼日，武金才，陳鑫蘋，張震生，鄭進方，王 雨，劉向梅

細胞周期蛋白 B1（cyclin B1，CCNB1）在機體生長發(fā)育、細胞凋亡、分化和腫瘤形成等病理生理過程中有重要的意義[1-5]，研究也發(fā)現(xiàn)肝癌組織CCNB1水平較正常肝組織高[6]，并與肝癌分級、細胞分化、侵襲性和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等相關(guān)[7，8]。有研究表明，CCNB1高表達與非小細胞肺癌、食管鱗癌等腫瘤患者臨床預(yù)后密切相關(guān)[9，10]。本研究探討了mi-RNA-144脂質(zhì)體復(fù)合物對HepG2和SMMC-7721細胞在體外的增殖、遷移和侵襲作用，并研究了其在裸鼠體內(nèi)對種植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、試劑與儀器 人肝癌SMMC-7721細胞株（ATCC公司）；HepG2細胞株（ATCC公司）；BALB/c裸鼠（成都達碩實驗動物有限公司，鼠齡6～8周）。miR-144質(zhì)粒(上海華大基因有限公司）；DOTMA（Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA）；大豆卵磷脂（Lipid S100，批號：790589-81903，德國Lipoid公司）；膽固醇（上海伯奧生物科技有限公司）；氯仿（天津市進豐化工有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibico公司；青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；Transwell（Millipore公司，美國）；胰蛋白酶-EDTA消化液（中國碧云天生物技術(shù)有限公司）；EGFP質(zhì)粒（本實驗室抽提）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（型號為R-501，上海申順生物科技有限公司）；低溫冷卻液循環(huán)泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；超聲細胞破碎儀（Sonics&Materials Inc.，Newtown，USA；Model：VCX130；Power:130 w;Frequency:20 kHz）；納米粒度及電位分析儀（Malvern Instruments Limited，Worcestershire，UK.Model：2EN3600）；超凈工作臺（蘇凈安泰AIRTECH）；BB15細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；酶標分析儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司，BS-1101）；BD 流式細胞儀 （Flow Cytometry，美國BD Bioscience公司）。

1.2 miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物的制備及表征 取DOTMA、膽固醇和大豆卵磷脂的摩爾比為50：30：20，得到的脂質(zhì)體溶液總摩爾濃度為10 mM。用薄膜分散法制備DOTMA陽離子脂質(zhì)體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h，50 r/m，37℃；用 PBS水化 30 min，75 r/m，60℃；將所得脂質(zhì)混懸液60℃探超3 min（85%，超聲3 s、停3 s）；將所得的脂質(zhì)體溶液過0.22 μm 水系濾膜，除去粒徑較大的脂質(zhì)體。按體積/質(zhì)量比（μl/μg）為 1:1、2:1、3:1、4:1 和 5:1，將制備好的 DOTMA陽離子脂質(zhì)體與miR-144質(zhì)粒在室溫下孵育30 min，得到miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物，用納米粒度及電位分析儀測所得脂質(zhì)體的粒徑大小、分散度和Zeta電位。

1.3 miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物攝取實驗 制備載香豆素miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物，香豆素的濃度為25μg/ml。將培養(yǎng)的SMMC-7721和HepG2細胞鋪在24孔板中，10萬個/孔，培養(yǎng)24 h過夜。將體積/質(zhì)量比為 1:1、2:1、3:1、4:1 和 5:1 的 miR-144 脂質(zhì)體復(fù)合物加入培養(yǎng)過夜的SMMC-7721和HepG2細胞24孔板中，香豆素的終濃度為10 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，收集細胞，用流式細胞儀檢測攝取結(jié)果。

1.4 EGFP脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染實驗 制備DOTMA陽離子脂質(zhì)體，將DOTMA陽離子脂質(zhì)體與EGFP質(zhì)粒按體積/質(zhì)量比為 1:1、2:1、3:1、4:1 和 5:1 共孵育，制備得到不同體積/質(zhì)量比的EGFP脂質(zhì)體復(fù)合物。將培養(yǎng)的SMMC-7721和HepG2細胞鋪在24孔板中，10萬個/孔，培養(yǎng)24 h過夜。將制備得到的EGFP脂質(zhì)體復(fù)合物加入到培養(yǎng)過夜的SMMC-7721和HepG2細胞24孔板中，EGFP質(zhì)粒為1 μg/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，用流式細胞儀檢測攝取結(jié)果。

1.5 細胞毒性實驗 采用MTT法，取SMMC-7721細胞和HepG2細胞，接種于96孔板，5×103個/孔，培養(yǎng)24 h過夜。實驗分為PBS組、游離miR-144組和miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物組，分別加PBS、游離miR-144和miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物到培養(yǎng)過夜的SMMC-7721細胞和HepG2細胞96孔板中，分別孵育12 h、24 h和48 h，每孔加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），4 h后移去培養(yǎng)液，每孔再加入150μL二甲基亞砜，振搖均勻，用酶標儀測定570 nm處的吸光度，計算細胞生存率，每組細胞設(shè)5個重復(fù)孔。

1.6 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗（wound healing assay）法，取SMMC-7721細胞和HepG2細胞，待細胞匯合度達到80%～90%時，分別加入游離miR-144和miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物，而空白對照組不作任何處理，每組設(shè)5個復(fù)孔。12 h后劃線，48 h后，應(yīng)用Image plus軟件測量細胞劃痕間的遷移距離，重復(fù)3次。

1.7 細胞侵襲能力檢測 取出-20℃保存的Matrigel膠（BD），置于4℃冰箱過夜，凍融備用。將Matrigel膠和培養(yǎng)液按1：7進行混合，均勻鋪滿在Transwell小室膜上（50貝/孔），放置于細胞培養(yǎng)箱中；將對照和用miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物處理好的SMMC-7721細胞和HepG2細胞進行常規(guī)消化、離心后，用無血清培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整為合適的細胞數(shù)；將細胞懸液接種到Transwell小室的上室，在24孔板中加入含有血清的培養(yǎng)基，將Transwell小室的上室置于24孔板孔內(nèi)，共同培養(yǎng)，再置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)36 h；3 h后取出Transwell小室，用濕潤的棉簽小心擦掉微孔膜上層的細胞，用95%乙醇固定5 min，再轉(zhuǎn)移至含有結(jié)晶紫的容器中染色5 min，用PBS反復(fù)洗3次。在顯微鏡下計數(shù)，每組設(shè)3個小室，實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.8 腫瘤模型的建立及其處理 取對數(shù)生長的SMMC-7721細胞和HepG2細胞，用胰酶消化，PBS洗滌3次，用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整SMMC-7721細胞密度為2.5×107個/mL,調(diào)整HepG2細胞密度為5×107個/mL。取36只BALB/c裸鼠，隨機分成6組，每組6只，分別為SMMC-7721細胞接種組、游離miR-144組和miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物組，以及HepG2細胞接種組、游離miR-144組和miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物組。在右腋部皮下接種SMMC-7721細胞懸液200 μL（5×106個細胞）或 HepG2細胞懸液 200 μL（1×107個細胞）。在接種細胞 4 d后，用游標卡尺測量腫瘤體積，用天平測量裸鼠體質(zhì)量，每3 d測量1次。用公式：V=πab2/6（V：體積，a：腫瘤長徑，b：腫瘤短徑）計算腫瘤體積。腫瘤體積均大于 0.1 cm3為造模成功。在接種細胞成瘤后，分別給予游離miR-144和miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物腹腔注射，1次/d；在對照組，則注射等體積的生理鹽水，1次/d。連續(xù)注射15 d，在注射當(dāng)天和第 3 d、7 d、9 d、11 d 和 13 d，測量裸鼠體質(zhì)量和瘤塊體積。在第13 d，采用頸椎脫臼法處死小鼠，剝離出完整的瘤塊，稱量其質(zhì)量，分別計算游離miR-144和miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物抑瘤率，計算公式為：抑瘤率=（對照組平均瘤質(zhì)量－實驗組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Epidata 3.1錄入數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料的比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物的基本特征 隨著體積/質(zhì)量比的增加，miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物粒徑逐漸減小，Zeta電位逐漸增加（P＜0.05）；當(dāng)體積 /質(zhì)量比為 1：1 和 2：1 時，其多分散性指數(shù)（PDI）大于 0.3；當(dāng)體積 /質(zhì)量比為 3：1、4：1 和 5：1 時，其 PDI均小于0.3（表1）。

表1 miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物基本特征

2.2 細胞攝取miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物情況 在攝取2 h，隨著陽離子脂質(zhì)體積/miR-144質(zhì)量的比例增大，SMMC-7721和HepG2細胞均對miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物的攝取增加（P＜0.05）。

2.3 細胞轉(zhuǎn)染EGFP脂質(zhì)體復(fù)合物情況 在脂質(zhì)體體積/EGFP質(zhì)量（μl/μg）為 3:1時，EGFP脂質(zhì)體復(fù)合物在SMMC-7721細胞和HepG2細胞轉(zhuǎn)染效率最高（P＜0.05）。

2.4 各組細胞成活情況 DOTMA脂質(zhì)體對SMMC-7721細胞和HepG2細胞的毒性較游離miR-144質(zhì)粒增高。隨著孵育時間的延長，miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物對SMMC-7721細胞和HepG2細胞的殺傷作用均增加（P＜0.05，圖1、圖2）。

圖1 不同孵育時間下miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物對HepG2細胞的殺傷作用

圖2 不同孵育時間下miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物對SMMC-7721細胞的殺傷作用

2.5 各組細胞遷移能力比較 經(jīng)miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物處理過的HepG2細胞和SMMC-7721細胞遷移距離顯著短于游離miR-144組和空白對照細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.6 各組細胞侵襲能力比較 經(jīng)miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物處理的HepG2細胞侵襲距離為（22.3±4.76）μm，SMMC-7721細胞侵襲距離為（22.3±4.76）μm，均顯著低于空白對照組的【（62.6±6.83）μm，P<0.01）】。

2.7 各組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化的比較 各處理組和對照組荷瘤裸鼠腫瘤體積均不斷增大（P<0.01）；與對照組比，接種經(jīng)過miR-14-LPX處理的SMMC-7721細胞形成的腫瘤體積顯著小于對照組和miR-14處理組（P<0.01）；接種HepG2細胞形成的腫瘤與接種SMMC-7721細胞相似（表2）。

表2 各組荷瘤裸鼠腫瘤體積（cm3，±s）比較

表2 各組荷瘤裸鼠腫瘤體積（cm3，±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與 miR-14 組比，②P＜0.01

V1 V3 V7 V9 V13 SMMC-7721細胞對照 267.3±43.2 397.8±43.3 702.7±132.1 830.8±113.8 1127.6±213.7 miR-14 262.2±66.3 386.5±52.7 680.2±116.3 799.6±136.7 1090.5±135.9 miR-14-LPX 250.6±88.3 328.7±43.8①② 466.2±106.6①② 500.5±127.3①② 536.7±136.3①②HepG2細胞對照 268.5±48.6 390.6±72.3 706.6±125.8 886.3±116.4 1237.3±162.7 miR-14 280.3±56.3 380.8±78.2 699.3±109.8 860.5±100.4 1109.5±137.2 miR-14-LPX 225.3±58.86 316.6±89.6①② 478.6±121.0①② 558.6±138.6①② 606.2±121.8①②

3 討論

miR-144能夠靶向抑制CCNB1的表達，從而抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脂質(zhì)體體積/EGFP質(zhì)量為3：1時，EGFP脂質(zhì)體復(fù)合物在SMMC-7721細胞和HepG2細胞的轉(zhuǎn)染效率最高。miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物對SMMC-7721細胞和HepG2細胞具有殺傷作用。經(jīng)miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物處理的HepG2細胞和SMMC-7721細胞侵襲能力都顯著下降[12]。miR-144脂質(zhì)體復(fù)合物能夠抑制裸鼠種植瘤的生長。有研究表明，miR-144的可能靶基因包括Apaf-1、Caspase-3和LGR4等，凋亡蛋白酶激活性因子-1與細胞色素形成多聚復(fù)合體，并募集Caspase-9前體，從而使其自我剪切并啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細胞凋亡。