張小三，張一鳴，楊樹軍，戚春輝，劉 凱，趙 燕

MicroRNAs（miRNAs）是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA[1～3]。miRNAs的分子量不大，約為20～40個核苷酸，但miRNAs的生物合成主要在細胞核和胞漿內(nèi)完成[4～7]。本研究在體外觀察了miR-21對HepG2細胞增殖和凋亡的影響，以探討HCC的發(fā)生機制。

1 資料與方法

1.1 試劑 DMEN培養(yǎng)基，Lipofectamine2000（Invitrogen）；PRO-PREPTM蛋白提取溶液（INTRON Biotechnology，Korea）；Bio-Rad 蛋白測定試劑盒（Hercules，USA）；Immobilon-P 膜 和Immobilon Wertern化學發(fā)光辣根過氧化物酶底物（Merck Millipore）；X 射線膠片 （GE Health-care，USA）；FBS、PBS、胰蛋白酶（美國 Hyclone）；細胞增殖活性檢測試劑盒（Cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁公司）；Annexin V-PE/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物）；Has-miR-21mimics和HasmiR-21 inhibitor（上海吉瑪）。

1.2 Hep G2細胞培養(yǎng)和傳代 自液氮罐中取出Hep G2細胞凍存管，放入37℃水浴箱中，輕搖、融化，以75%酒精棉球擦拭超凈工作臺，將細胞轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，加入DMEM培養(yǎng)基，以8000 r/m離心5 min，棄去上清液；再用DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS和1%抗生素）1 ml，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至含有DMEM培養(yǎng)基4 ml的培養(yǎng)皿中，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。待Hep G2細胞生長至90%左右時，進行傳代，倒掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，加入0.25%胰酶2 ml，并放入培養(yǎng)箱中消化細胞；隨后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，加入DMEM培養(yǎng)基4 ml，終止胰酶消化，用移液管輕輕吹打細胞；最后，以1:4比例把細胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿加入DMEM培養(yǎng)基4 ml。接種Hep G2細胞于6孔板，接種密度約為50%，并用不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；將細胞分為三組，即增強組、抑制組和對照組，分別用Lipofectamine 2000和Hsa-miR-21 mimics（50 nm/L）、Lipofectamine 2000和Has-miR-21 inhibitor（100 nm/L）進行轉(zhuǎn)染或者用Lipofectamine 2000進行處理。48 h后收集細胞。

1.3 Hep G2細胞 B細胞異位基因 2（B-cell translocation gene 2，BTG2）蛋白表達檢測 采用Western blot法，取Hep G2細胞，按1×106個細胞/孔，接種于6孔板，分別加入 Lipofectamine 2000和Has-miR-21 mimics（50 nm/L）、Lipofectamine 2000和Has-miR-21 inhibitor（100 nm/L）或Lipofectamine 2000，溫育48 h。當細胞達到80%融合時，收取細胞，重懸于PRO-PREPTM蛋白提取溶液中。將每個樣品的勻漿于4℃ 下以3000 r/m離心10 min，除去細胞碎片，并收集上清液。使用Bio-Rad蛋白測定試劑盒測量每個上清液樣品的總蛋白。提取總蛋白，測定蛋白濃度后，每孔上樣蛋白40 μg。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜。加入羊多克隆抗BTG2抗體（Santa Cruz公司）孵育1 h，漂洗后，加入二抗染色。采用Immobilon Wertern化學發(fā)光辣根過氧化物酶底物和X射線膠片進行蛋白分析并拍照。

1.4 細胞增殖檢測 采用CCK-8法，將增強組、抑制組和對照組細胞以每孔4000個分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個復孔。分別在接種后24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h 加入 CCK-8 溶 液10μL，37℃孵育2 h。使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度（absorbance value，A）值。計算細胞增殖抑制率（inhibitory rate，IR），即 IR=［1－實驗組 A值／對照組A值］×100%，實驗重復3次。

1.5 細胞周期和凋亡檢測 使用流式細胞儀檢測，在細胞轉(zhuǎn)染后72 h，用0.25%胰酶分別消化增強組、抑制組和對照組細胞，用PBS清洗2次，再以1000 r/m離心5 min，去上清。加入PBS 1 ml，吹打成單細胞懸液，分別加入Annexin V-PE和7-AAD，室溫下避光孵育15 min，上流式細胞儀（Backman coulter），檢測各組細胞凋亡率。另3組細胞用于檢測細胞周期，同樣先用胰酶消化，用PBS吹打細胞 2次，1000 r/m離心5 min，去上清。用70%乙醇1 ml，將細胞吹打均勻，細胞經(jīng)固定過夜后，上流式細胞儀，分析各組細胞周期。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，先行方差齊性檢驗，當方差齊時再行方差分析，采用Dunnet t法進行組間比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞BTG2蛋白表達的變化 轉(zhuǎn)染HasmiR-21 mimics的增強組細胞BTG2蛋白表達水平最低，轉(zhuǎn)染Has-miR-21 inhibitor的抑制組細胞BTG2蛋白表達水平最高，只用Lipofectamine 2000處理的對照組細胞BTG2蛋白表達水平強于增強組而低于抑制組（圖1），組間差異比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 各組細胞BTG2表達水平比較

2.2 各組細胞增殖水平的比較 自24 h開始，抑制組細胞增殖率較增強組和對照組明顯降低（P＜0.05），增強組較對照組明顯增強（P＜0.05）；在 96 h，抑制組細胞生長抑制率有所下降，而增強組細胞生長抑制率有所回升（表1）。

2.3 各組Hep G2細胞周期變化的比較 與增強組或?qū)φ战M比，抑制組細胞周期S期明顯減少（P＜0.05），而 G2期則明顯增多（P＜0.05）；與對照組比，增強組S期明顯增加，而G2期明顯較少（P＜0.05）；各組G1期比較無顯著差異（P＞0.05，圖2）。

2.4 各組Hep G2細胞凋亡情況比較 與增強組和對照組比，抑制組細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），而與對照組比，增強組細胞凋亡率顯著減少（P＜0.05，圖3）。

表1 各組細胞OD值（±s）比較

表1 各組細胞OD值（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與增強組比，②P＜0.05

孔數(shù) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h增強組 3 0.30±0.02① 0.48±0.01① 1.06±0.03① 1.65±0.04① 2.10±0.05①抑制組 3 0.18±0.00①② 0.28±0.02①② 0.45±0.02①② 0.68±0.01①② 1.00±0.02①②對照組 3 0.23±0.02 0.36±0.01 0.75±0.03 1.13±0.03 1.52±0.05

圖2 各組細胞周期分布比較

圖3 各組Hep G2細胞凋亡率比較

3 討論

近年來，在腫瘤研究中miRNAs的地位不斷提高。越來越多的研究表明miRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有著十分重要的作用[9～12]。有研究指出，miRNAs作為一類新的調(diào)控分子，大約一半的miRNAs都位于與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因區(qū)域[13，14]。在miRNAs家族里，miR-21是一個與許多惡性腫瘤密切相關(guān)的miRNA。有大量研究表明，在胃癌組織，miR-21可抑制同源性磷酸酶-張力蛋白和程序性細胞死亡蛋白4（PDCD4）表達，促進胃癌細胞的生長和侵襲[15]。miR-21也是結(jié)直腸癌重要的生物學標志物，尤其是在早期診斷、靶點治療[16]和放射治療[17]等方面，發(fā)揮作用。miR-21能夠通過調(diào)節(jié)蛋白表達水平影響肺癌細胞的增殖和侵襲能力[18]。有關(guān)miR-21在肝細胞癌發(fā)病中的作用研究還比較欠缺。本研究結(jié)果表明miR-21對肝癌細胞的增殖和凋亡有著重要的作用。當下調(diào)miR-21的表達后可以明顯地抑制肝癌細胞HepG2細胞增殖，導致細胞阻滯在G2/M期，同時促進HepG2的凋亡。由于miRNAs對細胞生物功能的調(diào)控主要是通過影響其蛋白的表達，而已有相關(guān)研究報道，在喉癌細胞和前列腺癌細胞BTG2是mi R-21影響的表達蛋白，而本研究也發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞，miR-21能影響B(tài)TG2表達，對進一步研究HCC的發(fā)生機制，可能有幫助。

本研究采用Western blot法檢測BTG2蛋白的表達，采用CCK-8法檢測miR-21對HepG2細胞增殖的影響,并結(jié)合流式細胞術(shù)檢測了細胞周期和細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，在HepG2細胞，miR-21能抑制BTG2的表達，而CCK-8檢測結(jié)果則表明，miR-21對HepG2細胞增殖的影響與作用時間有關(guān)，即自24 h開始，抑制組細胞吸光度值較增強組和對照組明顯降低，而增強組較對照組明顯增強。FCM檢測進一步顯示與增強組和對照組比，抑制組細胞周期S期明顯減少，G2期則明顯增多，而與對照組相比較，增強組S期細胞明顯增加，G2期細胞明顯減少，但各組G1期測報比例無顯著差異。此外，與增強組和對照組比較，抑制組細胞凋亡率明顯增加，而與對照組比，增強組細胞凋亡率明顯減少。研究已經(jīng)證實，miRNA的分子量較小，而其生物合成需要在細胞核和胞漿內(nèi)完成[7]。miRNAs在人類基因調(diào)節(jié)中的作用十分重要[8]，在目前已知的大約1870個人類miRNAs序列中，人類約三分之一的基因表達受其調(diào)控。人體肝臟內(nèi)存在著大量的miRNAs，不僅調(diào)節(jié)肝臟的生長發(fā)育，還與HCC的形成密切相關(guān)。在HCC形成過程中，miRNAs可作為抑癌基因或致癌基因調(diào)節(jié)肝癌細胞的血管生成、細胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等[9，10]。