郭樂(lè)樂(lè)，張曉慧，張向穎，胡中杰，任 鋒，張 晶

對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）和含有APAP的藥物是最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床上主要用于普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱，以緩解輕至中度疼痛[1]。Schegg et al[2]發(fā)現(xiàn)Colgalt2為介導(dǎo)膠原Glcαl和2Galβl-糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶，但其在急性肝損傷中的作用尚不清楚。本研究采用APAP制備急性化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型，通過(guò)研究Clogalt2基因及其蛋白的表達(dá)，以進(jìn)一步探討APAP的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 健康SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠100只，8～12 w齡，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)1 w，自由進(jìn)食水。APAP購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，將APAP溶于無(wú)菌1×PBS中，配置濃度為25 mg/ml，55℃水浴鍋加熱至完全溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用；Trizol裂解液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自日本TAKARA公司；PCR引物購(gòu)自上海生物化工有限公司；兔抗人GLT25D2多克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG均購(gòu)自Cell Signaling公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 急性肝損傷模型的制備 APAP濃度梯度模型的制備：取C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組和100 mg·kg-1、250 mg·kg-1、500 mg·kg-1和 1000 mg·kg-1APAP處理組。所有小鼠均禁食不禁水12 h。在對(duì)照組，給予1×PBS腹腔注射，在藥物處理組，分別給予不同濃度的APAP腹腔注射，給藥后繼續(xù)禁食不禁水，8 h后急性肝損傷模型建模成功，收集血清和肝組織用于各項(xiàng)檢測(cè)；APAP時(shí)間梯度模型制備：取C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組、2 h、4 h、8 h和12 h APAP處理組，分別給予PBS 或者 APAP（25 mg/ml）500 mg·kg-1腹腔注射。給藥后繼續(xù)禁食不禁水，分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集血清和肝組織，常規(guī)檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）；肝組織用于提取RNA、蛋白質(zhì)，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織損傷情況。

1.3 肝組織糖基轉(zhuǎn)移酶Colgalt2 mRNA相對(duì)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法，使用 TRIzol試劑提取肝組織總 RNA，測(cè)定總RNA濃度并配制等量總RNA溶液。Colgalt2引物：正向引物gcaatgattgaccgtcctcc，反向引物 tccacagcctcgacaatctt。使用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成 cDNA第一鏈，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為20μl，熱啟動(dòng) 95℃ 3 min；變性 95℃ 3 s、退火/延伸60℃延長(zhǎng) 30 s，共 40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用 Biorad manager Systerm Software伯樂(lè)分析軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，以次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）作為內(nèi)參基因。采用實(shí)時(shí)定量PCR的Ct（cycle threshold）均值來(lái)表示，相對(duì)定量采用 2-△△Ct來(lái)計(jì)算[3]。重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次。

1.4 肝組織Colgalt2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，取小鼠肝組織約30 mg，立即置于預(yù)冷的組織裂解液0.5 ml中，冰浴下充分勻漿，然后于冰上靜置 30 min，4℃下12000 g離心5 min，采用Bio-RadDc蛋白分析微孔板法測(cè)定上清液蛋白濃度。取肝組織50μg上樣，電泳開(kāi)始為80 v，當(dāng)?shù)鞍譓arker電泳至分離膠后調(diào)為 120 v，使蛋白充分分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜（300 mA），加入一抗（1：1000稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗（1：2000稀釋）室溫孵育1 h，1×TBST漂洗3次，取等量的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液混勻后，孵育聚偏氟乙烯膜，暗室壓片曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組樣本均數(shù)的兩兩比較采用One-way ANOVA分析（對(duì)方差齊性者用LSD-t檢驗(yàn)，對(duì)方差不齊者用Games-Howell法），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ALT和AST水平比較 見(jiàn)表1。在APAP濃度梯度模型，250 mg·kg-1APAP處理組動(dòng)物血清ALT和AST水平顯著升高（P＜0.05）；在APAP時(shí)間梯度模型，2 h APAP處理組動(dòng)物血清ALT和AST水平顯著升高（P＜0.05）。隨APAP干預(yù)劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠肝損傷逐漸加重。

2.2 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)變化 在APAP濃度梯度模型動(dòng)物，100 mg·kg-1APAP處理組肝小葉輪廓清楚，部分肝細(xì)胞輕度水腫，未見(jiàn)明顯壞死灶；在250 mg·kg-1、500 mg·kg-1和 1000 mg·kg-1APAP處理組，隨著APAP干預(yù)劑量的增大，肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂、肝細(xì)胞腫脹變性和壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出現(xiàn)片狀壞死和橋接壞死（圖1）。在APAP時(shí)間梯度模型動(dòng)物，2 h APAP處理組可見(jiàn)肝小葉輪廓清楚，部分肝細(xì)胞輕度水腫及少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；在4 h、8 h和12 h APAP處理組，肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂、肝細(xì)胞腫脹變性及壞死、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、大片狀壞死和橋接壞死（圖2）。

表1 各組血清ALT和AST水平（±s）比較

表1 各組血清ALT和AST水平（±s）比較

只 ALT（IU/L） AST（IU/L）對(duì)照組 10 28.6±5.3 130.7±24.0 APAP 100 mg·kg-1 10 33.6±4.1 144.6±17.3 250 mg·kg-1 10 1360.5±189.8 2147.1±133.4 500 mg·kg-1 10 3191.2±118.6 3628.8±107.9 1000 mg·kg-110 5022.7±234.6 5854.5±295.1對(duì)照組 10 26.7±4.6 107.8±24.0 APAP 2 h 10 80.7±8.0 247.1±23.9 4 h 10 694.1±63.5 857.5±69.2 8 h 10 1321.9±83.5 1658.5±109.5 12 h 10 3151.1±162.7 3395.2±620.6

圖1 APAP濃度梯度模型動(dòng)物肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

圖2 APAP時(shí)間梯度模型動(dòng)物肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

2.3 各組肝組織Colgalt2基因及其蛋白表達(dá)情況 見(jiàn)圖3、圖4。在 100 mg·kg-1和 250 mg·kg-1APAP 處理組肝組織Colgalt2基因水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而在 500 mg·kg-1和 1000 mg·kg-1APAP處理組，其水平顯著升高（P＜0.05）；2 h、4 h、8 h 和12 h APAP處理組與對(duì)照組比，肝組織Colgalt2基因水平逐漸升高（P＜0.05）。在濃度梯度模型，100 mg·kg-1APAP處理組肝組織 Colgalt2蛋白表達(dá)稍強(qiáng)于對(duì)照組，250 mg·kg-1、500 mg·kg-1和 1000 mg·kg-1APAP處理組Colgalt2蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)趨勢(shì)；在時(shí)間梯度模型，隨APAP干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織Colgalt2蛋白表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)。

圖3 兩種模型動(dòng)物肝組織Colgalt2基因水平變化

圖4 兩種模型動(dòng)物肝組織Colgalt2蛋白表達(dá)變化

3 討論

APAP和含有APAP的藥物是最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，APAP是引起急性肝衰竭最主要的原因[5，6]。APAP和含有APAP的藥物過(guò)量或者不恰當(dāng)服用，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，成人服用APAP最大日劑量不超過(guò)4 g[7]，過(guò)量攝入將導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，甚至肝衰竭[8，9]。APAP毒性呈劑量依賴性，在特殊情況下如禁食時(shí)，細(xì)胞色素P450誘導(dǎo)的藥物和酒精作用也會(huì)加重APAP引起的肝損傷[10]，可能原因是N-乙酰對(duì)苯醌亞胺（NAPQI）生成過(guò)多和谷胱甘肽（GSH）降低，NAPQI通過(guò)芳基化或使GSH等酶蛋白過(guò)氧化失活，生成自由基，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷[11]，并且多余的NAPQI與胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物是線粒體氧化應(yīng)激的最重要原因，同時(shí)也是肝細(xì)胞死亡最重要的起始事件[12]。

血清ALT和AST水平在一定程度上可以反映肝細(xì)胞損傷的程度[13]。本研究采用APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型，結(jié)果顯示，動(dòng)物血清ALT和AST水平隨著干預(yù)時(shí)間和干預(yù)劑量的逐漸延長(zhǎng)和增加而升高，肝組織學(xué)發(fā)生病理性改變，表明APAP可導(dǎo)致肝損傷，提示急性肝損傷模型制備成功。

蛋白質(zhì)糖基化是真核細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白、膜錨定蛋白、糖脂及蛋白聚糖的常見(jiàn)的翻譯后修飾過(guò)程，是指在肽鏈合成的同時(shí)或合成后，在酶的催化下糖鏈被接到肽鏈上的特定糖基化位點(diǎn)[14]。研究表明，蛋白質(zhì)的糖基化修飾在肝病的不同發(fā)病階段均發(fā)揮重要的作用[15]。蛋白質(zhì)糖基化主要有N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化和GPI錨定連接四類[16，17]。O-連接的糖基化修飾是蛋白質(zhì)最豐富的翻譯后修飾[18，O-糖基化主要包括粘蛋白型O-聚糖，即O-連接的-N-乙酰半乳糖胺[19]、O-連接的-N-乙酰葡萄糖胺[20]和修飾膠原蛋白的O-糖基化修飾[21]。Colgalt2編碼的跨膜蛋白膠原β（1-O）半乳糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)膠原分子上的羥基賴氨酸Glcαl和2Galβl-糖基化修飾[2]。為明確小鼠肝組織 Colgalt2與小鼠急性藥物性肝損傷之間的關(guān)系，本研究對(duì)APAP時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著APAP干預(yù)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，肝臟損傷逐漸加重，Colgalt2基因及其蛋白水平上調(diào)。與對(duì)照相比，小劑量APAP組肝臟損傷不明顯，Colgalt2基因表達(dá)下調(diào)，Colgalt2蛋白水平略有升高，而在大劑量APAP組肝臟損傷非常明顯，Colgalt2基因及其蛋白水平顯著上調(diào)。