柳 菡，龔玉霞，王繩蕓，余可垚，李靜靜，沈偉健，丁 濤，伊雄海，鄧曉軍，徐敦明，趙增運，吳 斌，張 睿，韓 深

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210019；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；3.廈門出入境檢驗檢疫局，福建 廈門 361026；4.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026)

自歐洲“毒雞蛋丑聞”[1]被公開以來，大量雞蛋及雞蛋類產(chǎn)品從歐洲各大超市下架。歐盟十五國、瑞士、韓國、香港和臺灣地區(qū)也都發(fā)現(xiàn)了被殺蟲劑氟蟲腈污染的雞蛋。氟蟲腈[2]是一種苯基吡唑類殺蟲劑，殺蟲譜廣，其作用機制為阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制的氯化物代謝，對魚、蝦、蜜蜂、家蠶高毒，持效期長，對環(huán)境極其不友好。氟蟲腈在中性和酸性溶液中穩(wěn)定，在堿性溶液中緩慢水解，光照下緩慢降解，在水溶液中經(jīng)光照可快速分解。氟蟲腈有光解產(chǎn)物氟甲腈，氧化產(chǎn)物氟蟲腈砜和還原產(chǎn)物氟蟲腈硫醚3種主要的代謝產(chǎn)物[3]。

歐盟對蛋中氟蟲腈(以氟蟲腈和氟蟲腈砜之和計)限量為0.005 mg/kg[4]；日本對蛋中氟蟲腈的限量要求為0.02 mg/kg[5]；中華人民共和國農(nóng)業(yè)部等三部委第1157號公告[6]規(guī)定，我國自2009年10月1日起禁用氟蟲腈，衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑除外；GB 2763—2016[7]規(guī)定，糧谷、油料、蔬菜、水果、糖料和食用菌中氟蟲腈(以氟蟲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜、氟甲腈之和計)的限量為0.02～0.10 mg/kg。

我國現(xiàn)有的氟蟲腈檢測方法標準有SN/T 1982—2007[8]、SN/T 4039—2014[9]、GB 23200.8—2016[10]、GB 23200.9—2016[11]、GB 23200.7—2016[12]等。上述標準主要針對植物源性產(chǎn)品，目標物只針對氟蟲腈，采用氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，定量限為0.002～0.066 mg/kg。目前，文獻報道的氟蟲腈檢測方法[13-20]多針對植物源性產(chǎn)品、血漿和尿液樣品，采用乙腈或丙酮提取，分散固相萃取、固相萃取、固相微萃取或液-液萃取凈化，氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。也有文獻[21-22]報道了水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法，分別采用乙腈水溶液和二氯甲烷-丙酮混合溶液提取，經(jīng)分散固相萃取凈化和液-液萃取-復(fù)合固相萃取柱凈化，氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜法測定。但液-液萃取和復(fù)合固相萃取柱凈化的操作較為繁瑣，使用的有機溶劑量較大；復(fù)雜動物源性樣品中干擾較多，氣相色譜法的定性能力較弱，難以滿足分析要求。

目前，蛋及蛋制品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23]、氣相色譜-質(zhì)譜(負化學(xué)源)法[24]和液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法[25]。時逸吟等[23]采用含0.1%甲酸的乙腈溶液提取雞蛋、雞肉等食品中的氟蟲腈及其代謝物，經(jīng)無水硫酸鎂、氯化鈉和檸檬酸鈉鹽析，分散固相萃取凈化后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。沈偉健等[24]采用乙腈提取雞蛋和蛋制品中的氟蟲腈及其代謝物，經(jīng)分散固相萃取凈化后，氣相色譜-負化學(xué)源質(zhì)譜法檢測。郭德華等[25]采用0.1%甲酸乙腈溶液提取雞蛋、蛋糕等食品中氟蟲腈及其代謝物，經(jīng)固相萃取凈化，液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法測定。但未見采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蛋和蛋制品中氟蟲腈及其代謝物的報道。

本研究擬采用QuEChERS技術(shù)[26]從提取溶劑、鹽的選擇和用量、分散固相萃取劑的選擇和用量，對氟蟲腈回收率的影響進行考察，優(yōu)化前處理方法，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測氟蟲腈及其代謝物的殘留量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B-7000C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；KQ-250DE超聲儀：中國昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A渦旋混勻器：中國上海醫(yī)大儀器廠產(chǎn)品；LDZ5-2離心機：德國Sigma公司產(chǎn)品；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈硫醚和氟蟲腈砜標準物質(zhì)：純度均大于99%，德國Sigma公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：德國Merck公司產(chǎn)品；乙腈、冰醋酸、氯化鈉：均為分析純，南京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、十八烷基硅烷(C18)：賽分科技有限公司產(chǎn)品；實驗用水為Milli-Q去離子水；雞蛋、蛋粉、冰蛋和皮蛋樣品：均購自超市。

1.2 溶液的配制

1.2.1標準儲備液的配制 分別稱取適量的標準物質(zhì)，用乙腈溶解，配制成1.0 g/L的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。

1.2.2混合標準溶液的配制 分別移取適量的標準儲備液，用乙腈配制成1.0 mg/L的混合標準溶液，于-18 ℃避光保存。

1.2.3基質(zhì)標準工作溶液的配制 量取一定體積的混合標準溶液，根據(jù)需要用陰性樣品提取凈化后，將溶液稀釋成適用濃度的基質(zhì)標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 前處理方法

1.3.1提取 準確稱取適量的樣品(10 g鮮蛋和冰蛋，5 g蛋粉和皮蛋，精確至0.01 g)至50 mL塑料離心管中，加適量的水(鮮蛋和冰蛋加5 mL水，蛋粉和皮蛋加10 mL水)，渦旋30 s，充分混合均勻；加入25 mL 0.1%冰醋酸乙腈溶液，渦旋1 min；加入5 g氯化鈉，劇烈振搖1 min；超聲提取15 min，以8 000 r/min離心3 min，取上層清液至雞心瓶中；向殘渣中再加入15 mL 0.1%冰醋酸乙腈溶液，劇烈振搖1 min；超聲提取15 min，以8 000 r/min離心3 min，取上層清液，合并2次上清液至雞心瓶；于40 ℃水浴中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

1.3.2凈化 向樣品提取物中加入適量的乙腈(鮮蛋和冰蛋加2.0 mL，蛋粉和皮蛋加1.0 mL)，渦旋1 min，將溶液轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入100 mg PSA、150 mg GCB、50 mg C18的試管中，渦旋1 min，過0.22 μm有機濾膜至進樣小瓶，待GC-MS/MS分析。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：HP-5MS 彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度70 ℃，以25 ℃/min升至300 ℃，保持2.8 min；載氣(He)流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；脈沖不分流進樣(脈沖壓力1.72×105Pa)，1.50 min后打開分流閥；進樣口溫度270 ℃。

1.4.2質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；碰撞氣：高純氮氣(≥99.999%)；數(shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，詳細信息列于表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的多反應(yīng)監(jiān)測信息Table 1 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters of fipronil and its metabolites

注：*表示定量離子

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

本研究采用QuEChERS法從提取溶劑、提取方式、鹽的選擇和用量、分散固相萃取劑的選擇和用量4個方面進行優(yōu)化。由于氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈、氟蟲腈砜4種化合物中氟蟲腈在GC-MS/MS上的響應(yīng)最低，且4種化合物隨條件變化的規(guī)律一致，故以氟蟲腈為代表，通過比較不同條件下氟蟲腈的回收率變化，優(yōu)化前處理條件。

2.1.1提取溶劑的選擇 提取溶劑應(yīng)對氟蟲腈及其代謝物有較好的溶解性，而對樣品基體里的雜質(zhì)有盡量低的提取能力，同時具有沉淀蛋白的作用。根據(jù)氟蟲腈及其代謝物的溶解性、極性和穩(wěn)定性，本研究分別考察了乙酸乙酯、丙酮、乙腈、0.1%冰醋酸乙腈溶液作為提取溶劑的提取效果。丙酮和乙腈與水互溶，為了改善沉淀蛋白的效果，促進待測物向有機溶劑中轉(zhuǎn)移，需要在提取后加入適量的氯化鈉，以除水并鹽析。乙酸乙酯提取液比丙酮、乙腈、0.1%冰醋酸乙腈的提取液渾濁，可能是由于乙酸乙酯對油脂有一定的提取能力；丙酮提取液顏色比其他提取液深，可能是由于丙酮對色素的提取能力較強。GC-MS/MS分析結(jié)果表明，經(jīng)4種溶劑提取后，氟蟲腈樣品峰面積均大于等濃度標準溶液峰面積，即存在一定的基質(zhì)增強效應(yīng)。因此，配制各溶劑條件下同等濃度基質(zhì)標準溶液，以單點法校正各溶劑條件下的加標回收率，結(jié)果列于表2。實驗最終選擇0.1%冰醋酸乙腈作為提取溶劑。

2.1.2提取方式的選擇 為了盡量完全提取蛋及蛋制品中的氟蟲腈及其代謝物，需要使樣品充分稀釋或分散，使提取溶劑充分滲透，并混合均勻。常用的提取方式有振搖、渦旋、超聲、振蕩等。鮮蛋和冰蛋樣品含有一定的水分，向10 g樣品中加入5 mL水可以充分稀釋和混勻，加入提取溶劑后渦旋即可充分滲透，確保后續(xù)超聲提取的效果。蛋粉和皮蛋樣品中含水量較少，向10 g樣品中加入5 mL水，仍呈較濃稠的糊狀，加入提取溶劑后，渦旋、超聲或猛烈振搖均不能實現(xiàn)充分滲透。故將蛋粉和皮蛋樣品的稱樣量減至5 g，加水量增至10 mL，樣品得到充分稀釋，形成混懸液，加入提取溶劑后，渦旋能夠使提取溶劑充分滲透，后續(xù)的超聲提取完全。對超聲提取時間進行考察，結(jié)果表明超聲10 min以上時，回收率無顯著增加，但為了保證充分提取，選擇超聲提取15 min。

表2 不同提取溶劑對氟蟲腈的提取效率(n=2)Table 2 Extraction efficiency of fipronil with different extraction solvents (n=2)

2.1.3分散固相萃取劑的選擇和用量

QuEChERS法常使用分散固相萃取劑(如十八烷基硅烷(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳黑(GCB))以達到除雜凈化的目的。C18可除去基質(zhì)中脂肪等弱極性化合物；PSA可除去基質(zhì)中有機酸等極性化合物；GCB可吸附色素等物質(zhì)。本研究以此為三因素，選擇50、100、150 mg 3個質(zhì)量水平，以正交實驗法進行優(yōu)化，實驗設(shè)計和結(jié)果列于表3?？梢钥闯?，各凈化條件下均存在一定的基質(zhì)增強效應(yīng)， GCB是影響凈化效果最重要的因素，隨著GCB量的增加，回收率降低，即基質(zhì)增強效應(yīng)減弱，故選擇GCB加入量150 mg；隨著PSA量的增加，回收率降低，即基質(zhì)增強效應(yīng)減弱，當加入100 mg以上時，對回收率沒有顯著影響，故選擇PSA加入量100 mg；C18量的增加對回收率沒有顯著影響，為在達到凈化目的的前提下使用較少的凈化劑，故C18加入量為50 mg。

2.1.4基質(zhì)效應(yīng) 按上述確定的凈化條件配制基質(zhì)標準溶液，同時配制未經(jīng)凈化的基質(zhì)標準溶液，與溶劑標準溶液同時進行分析，峰面積結(jié)果列于表4。凈化后基質(zhì)標準溶液中氟蟲腈峰面積是同等濃度溶劑標準溶液峰面積的140%，而未經(jīng)凈化的基質(zhì)標準溶液中氟蟲腈峰面積是同等濃度溶劑標準溶液的261%?？梢?，采用優(yōu)化后的分散固相萃取條件凈化樣品，基質(zhì)增強效應(yīng)可大幅度降低，但是仍存在一定的基質(zhì)增強，為了定量的準確性，采用基質(zhì)校正曲線定量。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

在不同的碰撞能量下，采用GC-MS/MS法分析氟蟲腈及其代謝物標準溶液，優(yōu)化后的最佳母離子/子離子對和碰撞能量列于表1。陰性鮮雞蛋基質(zhì)標準溶液的GC-MS/MS譜圖示于圖1。

表3 正交實驗的結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

表4 樣品凈化前后的基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Matrix effect of sample before and after purification

注：a.氟甲腈；b.氟蟲腈硫醚；c.氟蟲腈；d.氟蟲腈砜圖1 陰性鮮雞蛋基質(zhì)標準溶液(2.0 μg/L)的GC-MS/MS圖Fig.1 GC-MS/MS spectrum of fipronil and its metabolites in negative chicken egg extraction solution (2.0 μg/L)

2.3 方法的線性范圍、標準曲線和定量限

以標準品的峰面積(y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。在2～100 μg/L濃度范圍內(nèi)，氟蟲腈及其代謝物具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.99。以信噪比等于10確定方法的定量限為1.0 μg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

選擇1.0、2.0、4.0、20.0 μg/kg四個加標水平對鮮雞蛋、全蛋粉、冰蛋和皮蛋進行加標實驗，回收率為72.0%～109.5%，精密度為7.8%～15.8%，具體數(shù)據(jù)列于表5。

2.5 實際樣品檢測

采用本研究建立的方法對市售的200批蛋和蛋制品進行檢測，結(jié)果表明，氟蟲腈及其代謝物均小于本方法的定量限。

3 結(jié)論

本研究采用改進的QuEChERS法提取和凈化樣品，建立了蛋和蛋制品中氟蟲腈及其代謝物殘留量的GC-MS/MS檢測方法。該方法準確、靈敏、簡便，回收率和精密度均能夠滿足蛋和蛋制品中氟蟲腈及其3種代謝物的檢測要求，可為蛋及蛋制品中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定提供方法參考。