張雅靜，馬驂，梁歡，相成，張燕

厄洛替尼是一種特異性的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase Inhibitors，EGFR TKIs)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制ATP與受體胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，從而抑制酪氨酸激酶活化，阻斷EGFR的傳導(dǎo)通路，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。目前已廣泛應(yīng)用于EGFR敏感突變的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的治療，不但使患者的中位生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且總體耐受良好[1-2]。嗎啡作為阿片類藥物的代表，廣泛應(yīng)用于癌痛的治療，極大地提高了腫瘤患者生活質(zhì)量。但有研究發(fā)現(xiàn)，阿片類藥物可能影響腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[3-5]。因此，本文通過(guò)建立裸鼠成瘤模型進(jìn)一步在體內(nèi)觀察嗎啡聯(lián)合厄洛替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，為其臨床安全應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物： SD雄性裸鼠，4周齡，體質(zhì)量(15±3)g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003，于河北科技大學(xué)藥用分子實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件下分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水；裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，對(duì)照組、嗎啡組、厄洛替尼組、嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組(聯(lián)合組)，每組6只。

1.1.2 試劑及藥物： 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(HCC827)(中科院細(xì)胞庫(kù)),RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，TUNEL檢測(cè)試劑盒(Millipore)，BAX (Abcam，ab53154)、Caspase-3(Abcam，ab1384)、Bcl-2(Abcam，ab59348)，厄洛替尼(上海羅氏制藥有限公司)，鹽酸嗎啡片(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司)。

1.2 裸鼠成瘤模型構(gòu)建 2017年2—8月于河北科技大學(xué)藥用分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理： 使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCC827細(xì)胞，培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2+95%空氣孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.2.2 皮下成瘤： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCC827細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制成5×107/ml的單細(xì)胞懸液，于各組鼠前腋皮下注射200 μl。對(duì)照組每日胃飼生理鹽水 5 ml/d，嗎啡組胃飼含嗎啡(20 mg/kg)生理鹽水5 ml/d，厄洛替尼組胃飼含厄洛替尼(5 mg/kg)生理鹽水5 ml/d，嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組胃飼含嗎啡(20 mg/kg)和厄洛替尼(5 mg/kg)生理鹽水 5 ml/d。實(shí)驗(yàn)中裸鼠自由攝食飲水。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 腫瘤體積計(jì)算： 每周測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑(a)和瘤體短徑(b)，并計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=ab2/2。

1.3.2 腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)： 實(shí)驗(yàn)3周后處死裸鼠，分離新鮮腫瘤組織，部分用于磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，使用預(yù)先配制好的1×Binding Buffer 100 μl重懸細(xì)胞，按組別加入FITC Annexin Ⅴ 5 μl和PI染料5 μl震蕩混勻，室溫避光孵育15 min后加入1×Binding Buffer 400 μl混勻，流式細(xì)胞儀(FITC Annexin Ⅴ/PI雙染法)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。Annexin Ⅴ-FITC陽(yáng)性PI陰性細(xì)胞，代表早期凋亡率；Annexin Ⅴ-FITC陽(yáng)性PI陽(yáng)性細(xì)胞，代表晚期凋亡率。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3.3 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)： 上述剩余腫瘤組織標(biāo)本用眼科剪剪碎后加入大約5倍體積的組織裂解液，用玻璃研磨器將組織塊研碎，冰上裂解30 min，4℃低溫離心機(jī)高速離心(13 000 r/min 20 min)，提取上清液即為總蛋白。采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后行Western blot實(shí)驗(yàn)：抗Bax(1∶1 000)、Bcl 2(1∶500)、Caspase-3(1∶300)和抗GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。TTBS洗膜3次，每次20 min，加入HRP標(biāo)記的IgG(TTBS按1: 10 000稀釋)，37℃孵育1 h。TTBS避光洗膜3次，每次25 min，將ECL試劑盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，反應(yīng)1 min后對(duì)Western blot條帶進(jìn)行顯影，以目的條帶和GAPDH條帶的光密度值比值作為最終結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤體積比較 對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)迅速，隨時(shí)間延長(zhǎng)腫瘤體積明顯增大；嗎啡組腫瘤生長(zhǎng)緩慢，體積相對(duì)減小，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063)；厄洛替尼組及聯(lián)合組腫瘤生長(zhǎng)更為緩慢，裸鼠腫瘤體積均明顯縮小，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；與厄洛替尼組比較，聯(lián)合組變化不明顯(P=0.701)，見(jiàn)圖1。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01

2.2 腫瘤細(xì)胞凋亡率比較 各組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=126.287，P<0.01)。與對(duì)照組(11.77±0.71)%比較，嗎啡組腫瘤細(xì)胞凋亡率(13.87±1.97)%雖有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，厄洛替尼組(35.73±2.78)%和聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞凋亡率(37.17±2.39)%較對(duì)照組明顯增多 (t/P=20.455/<0.001,t/P=24.954/<0.001)；而厄洛替尼組與聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.969,P=0.353)，見(jiàn)圖2、3。

圖2 FITC AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)各組細(xì)胞凋亡圖

注:與對(duì)照組比較，aP<0.05

2.3 凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)比較 各組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=101.555、161.308、96.757，P<0.001)。與對(duì)照組比較，嗎啡組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，厄洛替尼組和聯(lián)合組Bcl-2表達(dá)減少，Bax和Caspase-3表達(dá)增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；厄洛替尼組與聯(lián)合組比較，Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4、5。

圖4 各組凋亡相關(guān)蛋白的電泳圖

注：與對(duì)照組比較，P<0.001

3 討 論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，EGFR基因突變的發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI類藥物如厄洛替尼的研發(fā)及臨床應(yīng)用，為亞裔尤其是中國(guó)攜帶EGFR敏感突變的肺癌患者帶來(lái)了更長(zhǎng)生存時(shí)間和更好的生活質(zhì)量[1-2]。肺癌目前居惡性腫瘤發(fā)病和死亡首位，5年生存率依然差強(qiáng)人意[6-7]。隨著病情進(jìn)展，大部分患者都會(huì)經(jīng)歷癌痛的折磨，嚴(yán)重影響患者的治療和生活質(zhì)量。依據(jù)“三階梯止痛”原則，嗎啡已被廣泛用于腫瘤患者癌痛的治療。但迄今為止，嗎啡等阿片類藥物與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的具體機(jī)制仍不清楚[3-5，8]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞學(xué)水平嗎啡、厄洛替尼以及嗎啡聯(lián)合厄洛替尼作用于HCC827細(xì)胞后，均可引起HCC827細(xì)胞凋亡率增加[9]。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)建立HCC827肺腺癌細(xì)胞裸鼠成瘤模型深入地研究嗎啡聯(lián)合厄洛替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響及其機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡組腫瘤生長(zhǎng)稍緩慢，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。厄洛替尼組及嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組腫瘤生長(zhǎng)更為緩慢，與對(duì)照組比較腫瘤體積明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與厄洛替尼組相比嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組腫瘤體積無(wú)明顯差別。該結(jié)果表明嗎啡聯(lián)合厄洛替尼時(shí)，嗎啡并未影響厄洛替尼抗腫瘤及延緩腫瘤生長(zhǎng)的作用。

凋亡作為細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡方式，在維持機(jī)體細(xì)胞新生及代謝平衡方面起著至關(guān)重要的作用[10-11]。為進(jìn)一步研究動(dòng)物水平嗎啡聯(lián)合厄洛替尼抗腫瘤機(jī)制，進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。既往研究表明Bcl-2屬于原癌基因家族，可通過(guò)抑制Caspase-3的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)[12]；敲除Bcl-2家族成員Bim可以引起內(nèi)源性藥物抵抗或者降低腫瘤細(xì)胞EGFR-TKIs的敏感性而產(chǎn)生耐藥[13]，Bax基因下調(diào)亦會(huì)導(dǎo)致厄洛替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)減弱[14-17]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)嗎啡作用于HCC827細(xì)胞可引起細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的變化[16]。

與對(duì)照組比較，嗎啡組細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與前期細(xì)胞水平結(jié)果不相一致[18]。其原因分析可能與體內(nèi)體外試驗(yàn)因素有關(guān)，亦可能與嗎啡濃度有關(guān)。劉紅軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡呈濃度依賴性的促進(jìn)MADB-106乳腺癌細(xì)胞的凋亡。厄洛替尼組及嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組細(xì)胞凋亡率明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與厄洛替尼組比較，嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組在細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差別(P>0.05)。進(jìn)一步說(shuō)明厄洛替尼或嗎啡聯(lián)合厄洛替尼應(yīng)用時(shí)可通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

嗎啡在緩解疼痛的同時(shí)并不會(huì)消弱厄洛替尼的抗腫瘤作用，本研究為嗎啡聯(lián)合厄洛替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌患者生活質(zhì)量的提升提供了理論基礎(chǔ)，為嗎啡和厄洛替尼的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突：無(wú)

作者貢獻(xiàn)聲明

張雅靜：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě);馬驂：提出研究思路，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);梁歡：實(shí)施研究過(guò)程，數(shù)據(jù)收集整理;相成：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;張燕：論文終審