王熙鳳，喬 軍，孟慶玲*，陳 英，鐘文強，貢莎莎，黃運福，才學(xué)鵬

(1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832003； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所， 甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】肝片吸蟲病是由肝片吸蟲(Fasciolahepatica，F(xiàn)h)引起的溫帶地區(qū)常見的一種人獸共患寄生蟲病。成蟲可寄生在草食動物肝膽管內(nèi)[1]，可造成家畜消化障礙、生長發(fā)育不良等癥狀，尤其對羔羊的危害最大[2-3]。同時，F(xiàn)h也可感染人，引起人的肝片吸蟲病，因此研發(fā)早期快速診斷方法對于該病的防治意義重大?！厩叭搜芯窟M展】草食動物感染Fh后，成蟲在宿主體內(nèi)可長期存在，蟲體的移行和排泄分泌產(chǎn)物可對宿主造成嚴重的危害，可致患病動物生產(chǎn)力低下，飼料利用率降低，每年給全球畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟損失高達30億美元[4]。近年來，隨著氣候的改變，該病逐漸擴散蔓延，目前在全球60多個國家均有發(fā)生。在我國，該病在新疆、內(nèi)蒙、青海等畜牧業(yè)發(fā)達的省區(qū)發(fā)病率逐年增高，在一些牧區(qū)，牛羊的感染率高達45 % ～100 %[5-6]。鞘脂激活蛋白樣蛋白(SAP)是一個大的蛋白家族，該蛋白含有5個半胱氨酸殘基和2個α-螺旋。該蛋白家族主要在Fh感染早期表達，在Fh成蟲分泌產(chǎn)物(ESP)中大量存在。SAP-2蛋白含有1個保守的三級結(jié)構(gòu)和3個二硫鍵，而二硫鍵的形成和正確折疊能提高蛋白的抗原性，并具有較強的細胞溶解酶活性，能殺死宿主紅細胞和白細胞，破壞宿主的免疫系統(tǒng)[7-8]，因此Fh SAP-2在蟲體的寄生和致病過程中發(fā)揮著重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對動物肝片吸蟲病診斷主要依賴于糞便中蟲卵檢查，但該方法敏感性較低，不適合早期感染的診斷。因此，研發(fā)Fh的早期感染診斷方法對于該病的防控具有重要的意義。已有研究發(fā)現(xiàn)，SAP蛋白在Fh感染早期可大量表達，造成宿主血細胞溶解，裂解肝細胞，是Fh重要的致病蛋白之一?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆SAP-2基因后在原核表達系統(tǒng)中進行表達，Western blot分析重組蛋白的反應(yīng)原性，以重組蛋白SAP-2為包被抗原建立檢測Fh抗體的間接ELISA，初步評估了SAP-2蛋白作為Fh血清學(xué)診斷抗原的潛力，為Fh血清學(xué)診斷試劑的研發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑

表達載體pET-32a(+)、E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院寄生蟲實驗室保存；限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和XhoI、DNA Marker、pMD19-T(simple)、T4DNA Ligase、IPTG、蛋白Marke、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、TMB和DAB顯色劑均購自天根生化科技(北京)有限公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG、NC膜購自康為世紀生物公司。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank已發(fā)表的SAP-2基因序列(登錄號：AF286903)，利用Premier 5.0軟件設(shè)計一對特異性引物F1和F2，F(xiàn)1：5′-CGGAATTCATGAACCCACTGTTCGTG-3′(下劃線部分為EcoR I酶切位點)，F(xiàn)2：5′-CCCTCGAGCTAGCACAGCTTGATTAAA CG-3′(下劃線部分為XhoI酶切位點)，引物由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 Fh總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取保存在-80 ℃的Fh成蟲，剪蟲體的1/3(約20 mg)，加入200 μl Trizol研磨成漿，按照Trizol法提取Fh總RNA，用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。

1.4 SAP-2基因的擴增及雙酶切鑒定

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，設(shè)計的特異性引物進行擴增SAP-2基因。RT-PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。切膠后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行目的片段回收，與pMD19-T(simple)載體4 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切鑒定，送至新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司進行測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD-SAP-2。

1.5 SAP-2基因及其編碼蛋白質(zhì)的分子特征分析

將測得的序列與NCBI上公布的SAP-2基因序列進行序列比對，并應(yīng)用DNAMAN、ProtParam、TMHMM、Protscale、SignalP、MotifScan、NetCTL 1.2 Server、DNAStar和BepiPred-2.0軟件分析預(yù)測SAP-2蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、等電點、疏水性、信號肽、跨膜區(qū)域、潛在的糖基化位點、細胞抗原表位等；通過Predictprotein和Swiss-model預(yù)測二級、三級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用MEGA軟件分析NCBI搜索得到的同源氨基酸序列，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 重組表達載體pET-SAP-2的構(gòu)建

用EcoR I和XhoI分別雙酶切pMD-SAP-2質(zhì)粒和pET-32a(+)原核表達載體，回收目的片段，與T4DNA連接酶4 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，經(jīng)菌液PCR和雙酶切篩選出陽性克隆，進行測序。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-SAP-2。

1.7 目的蛋白的誘導(dǎo)表達、鑒定及純化

將重組質(zhì)粒pET-SAP-2轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，37 ℃過夜培養(yǎng)，將300 μl菌液接種于200 mL含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8時，加入1.0 mmol/L IPTG(終濃度)誘導(dǎo)8 h，收集菌液，12 000 r/min離心1min收集菌體和上清，進行SDS-PAGE分析。將誘導(dǎo)后收集的菌液經(jīng)超聲破碎后，用鎳離子親和層析柱純化，調(diào)整終濃度為1 mg/mL。將純化的SAP-2蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，以綿羊Fh標準陽性血清(1∶

M: 標準DNA(DL2000); 1～2: SAP-2基因RT-PCR產(chǎn)物M: DNA marker(DL2000); 1-2: RT-PCR product of SAP-2 gene圖1 SAP-2基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物Fig.1 SAP-2 gene RT-PCR amplifications

1000稀釋)為一抗，以HRP標記的兔抗羊IgG抗體(1∶3000稀釋)為二抗，進行Westen blot分析。

1.8 基于SAP-2重組蛋白間接ELISA的建立及其對血清樣品的檢測評估

以純化后的SAP-2蛋白為抗原包被ELISA反應(yīng)板，蛋白稀釋濃度為2、4、6、8、10 μg/mL。ELISA反應(yīng)板每孔加100 μl抗原包被液，4 ℃過夜包被，棄去板內(nèi)包被液，PBST洗滌5次；每孔加入300 μl封閉液(含5 %脫脂奶粉的PBST)37 ℃封閉2 h，拍干反應(yīng)板，PBST洗滌3次；Fh陽性血清分別作1∶100、1∶200、1∶400和1∶800 4個梯度稀釋，100 μl每孔，37 ℃孵育1 h，拍干，PBST洗滌4次；二抗用HRP標記的兔抗羊IgG以1∶5000稀釋，100 μl每孔，37 ℃孵育1 h，拍干，PBST洗滌3次；用TMB顯色劑避光顯色15 min，H2SO4終止顯色，用酶標儀于OD450nm測定數(shù)值。P/N最大值確定為抗原和血清最佳濃度。計算出平均值(X)、標準方差(SD)，以臨界值=X+3×SD判定陰陽性。用建立的間接ELISA對實驗室保存的23份Fh陽性血清和10份陰性血清進行檢測，分析SAP-2蛋白在Fh診斷中的特異性和敏感性。

M：標準DNA(DL2000)；1～2：重組質(zhì)粒的雙酶切3：雙酶切對照M: DNA marker(DL2000); 1-2: Double enzyme digestion of recombinant plasmid; 3: Double enzyme contrast圖2 pMD-SAP-2質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 pMD-SAP-2 plasmid was identified by double enzyme digestion

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆及雙酶切鑒定

擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖檢測得到大小約306 bp的目的片段，與FhSAP-2基因片段預(yù)測結(jié)果一致(圖1)?；厥漳康钠闻cpMD19-T(simple)連接，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，挑取單菌落，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定，得到了2692 bp的載體片段和306 bp的目的片段，表明克隆載體pMD-SAP-2構(gòu)建成功(圖2)。

2.2 Fh SAP-2蛋白基因測序結(jié)果及其遺傳進化分析

圖3所示，SAP-2基因的閱讀框全長為306 bp，編碼101個氨基酸，該序列已上傳至NCBI(GenBank登錄號：MG457758)。序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank上公布的SAP-2核苷酸的同源性為99.35 %，氨基酸的同源性為97.3 %。SignalP分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白信號肽在第1～15個氨基酸之間。MotifScan預(yù)測該蛋白有1個N-糖基化位點(90～93)，1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(49～52)；有5個半胱氨酸殘基、3個B細胞抗原表位和2個T細胞結(jié)合位點。Predictprotein預(yù)測二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(α-helix)和無規(guī)卷曲(random coil)分別占70.3 %、29.7 %。Swiss-model預(yù)測三級結(jié)構(gòu)呈“U”形，α-螺旋由3個無規(guī)卷曲連接。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)h SAP-2與曼氏裂體吸蟲的SAP-2氨基酸序列同源性最高為98.02 %，其次是大片吸蟲為88.12 %，與其他物種表現(xiàn)出較大的種屬差異性(圖4)。

SAP-2基因引物序列(下劃線)；1個N-糖基化位點(斜體)；1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(波浪線)；B細胞抗原表位(陰影)；T細胞結(jié)合位點(黑體加粗)；5個半胱氨酸殘基(方框)Primer sequence (underline)；one N-glycosylation site (italic)；one casein kinaseⅡphosphorylation site (wave); B cell epitopes (shade); T cell binding site (Bold print); Five cysteine residues (block)圖3 SAP-2基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 cDNA sequence of SAP-2 gene and deduced amino acid sequence

圖4 SAP-2基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis based on nucleotide sequence of SAP-2 gene

M：標準DNA(DL5000)；1～2：重組質(zhì)粒的雙酶切；3：雙酶切對照M:DNA marker(DL5000); 1-2:Double enzyme digestion of recombinant plasmid; 3:Doube enzyme contrast圖5 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.3 原核表達載體pET-SAP-2的雙酶切驗證

用EcoR I和XhoI對重組子進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖驗證切出大小約5900 bp的表達載體片段和約306 bp的目的條帶(圖5)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明原核表達載體pET-SAP-2構(gòu)建成功。

2.4 SAP-2重組蛋白的SDS-PAGE及Western blot 分析

SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在27 kDa處有一條與預(yù)期大小一致的目的蛋白，而在上清液該位置無條帶，表明該蛋白以包涵體的形式表達。重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后，SDS-PAGE檢測可見到單一的目的蛋白條帶(圖6)。純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，進行Western blot分析，結(jié)果顯示在目的條帶大小處可見到單一條帶，證明純化后的重組蛋白SAP-2能與Fh陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性(圖7)。

M：蛋白marker；1：IPTG誘導(dǎo)的空載體；2～6：表達產(chǎn)物誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h； 7～8：SAP-2重組蛋白純化后M: Protein marker; 1: Empty-carrier induced by IPTG;2-6: The expression products were induced by 0, 2, 4, 6 and 8 hours; 7-8: SAP-2 recombinant protein after purification圖6 不同時間誘導(dǎo)融合蛋白表達的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of fusion protein expression induced by different time.

M：蛋白marker；1：純化后重組蛋白SAP-2M: Protein marker; 1: Purified recombinant protein SAP-2圖7 純化的重組蛋白SAP-2進行Western blot 檢測Fig.7 Western blot analysis of purified recombinant protein SAP-2

2.5 基于Fh SAP-2重組蛋白的間接ELISA的建立及其對血清樣品的檢測評估

經(jīng)ELISA試驗結(jié)果分析，陽性血清OD450nm為1.308，陰性血清為0.147時，P/N值最大，確定該蛋白的最佳包被濃度為6 μg/mL，一抗最佳稀釋濃度為1∶200。經(jīng)計算陰性平均值X為0.158，標準方差SD為0.062，計算出臨界值為0.344，大于臨界值的均為陽性，小于臨界值的為陰性。23份Fh陽性血清和10份陰性血清經(jīng)為1∶200稀釋后，陽性血清OD450nm均大于臨界值，均為陽性；陰性血清OD450nm均小于臨界值，均為陰性；該方法的檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全吻合，證明該重組蛋白具有良好的特異性和敏感性。

3 討 論

肝片吸蟲病雖然已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為被忽視的人畜共患病，但其嚴重危害人類和家畜的健康，給全球畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。目前，肝片吸蟲病的診斷主要包括糞便中蟲卵檢查和特異性抗體檢測。糞便中蟲卵檢查是Fh感染檢測的常用方法，但是蟲體一般都在感染后3～4個月才能成熟排卵，因此，糞便中蟲卵檢測不適合感染早期的診斷[9-13]。近年來，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的應(yīng)用，可提高該病診斷的準確性。Calvani等人結(jié)合傳統(tǒng)糞便沉淀方法，用實時熒光定量PCR技術(shù)，通過分離每克糞便中Fh蟲卵的DNA來進行早期檢測，該方法可用于特異性區(qū)分肝片吸蟲、大片吸蟲及其中間型，敏感度得到進一步提高[14]。

Fh成蟲在宿主體內(nèi)移行時可產(chǎn)生排泄分泌產(chǎn)物(ESP)，使蟲體逃避宿主的免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，ESP是由多種不同抗原蛋白組成，能誘導(dǎo)宿主獲得保護性免疫，是主要的保護性抗原，同時與細胞免疫抑制有關(guān)[15-16]。SAP是吸蟲ESP中的重要組成部分，SAP家族包含4種蛋白，在Fh中主要有SAP-1和SAP-2。SAP-1主要在成蟲階段表達，參與脂質(zhì)代謝，而SAP-2在未發(fā)育的蟲卵、童蟲和成蟲早期階段均可大量表達[17]。SAP-2可引起宿主紅細胞和白細胞的細胞膜溶解，還可裂解肝細胞[18]，是Fh重要的致病蛋白之一。

目前，對于Fh SAP-2蛋白的研究證實，該蛋白具有較強的免疫原性和反應(yīng)原性，可用于Fh診斷抗原和新型疫苗的研究[19]。Shin等通過免疫印跡(WB)和免疫熒光磁珠技術(shù)對Fh重組抗原GST-SAP2總IgG和IgG4進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組GST-SAP2的敏感性和特異性分別是94 %和98 %，證實Fh重組抗原GST-SAP2具有良好的反應(yīng)原性，具有作為Fh早期診斷試劑的潛力[20]。因此，本研究對SAP-2基因克隆后進行原核表達，利用Western blot分析其反應(yīng)原性。以純化的重組蛋白SAP-2為抗原，建立檢測Fh特異性抗體的間接ELISA，評估SAP-2蛋白作為Fh 診斷抗原的潛力。

4 結(jié) 論

試驗克隆了SAP-2基因，并在原核表達系統(tǒng)中高效表達了重組蛋白SAP-2，Western blot鑒定表明表達的重組蛋白SAP-2可被Fh陽性血清特異性識別，有較強的反應(yīng)原性。以純化的重組蛋白SAP-2為抗原，建立了檢測Fh特異性抗體的間接ELISA，結(jié)果證實重組蛋白SAP-2有良好的特異性和敏感性。本研究證實SAP-2蛋白具有作為肝片吸蟲病診斷候選抗原的價值，為Fh血清學(xué)診斷試劑研發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。