阿的魯驥, 周 健,李 潔，馬丹煒

(1. 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；2. 西南民族大學(xué)青藏高原研究所，四川 成都 610064；3．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與農(nóng)村經(jīng)濟(jì)研究所， 四川 成都 610066)

【研究意義】植物的光合作用是一系列復(fù)雜代謝反應(yīng)的總和。由于步驟繁多、過(guò)程復(fù)雜，任何一個(gè)反應(yīng)步驟受到影響都有可能影響到光合作用。生物體的所有生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程都受基因表達(dá)的調(diào)控，同樣光合作用也是相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】光合作用過(guò)程對(duì)環(huán)境變化十分敏感，在逆境脅迫下，植物光合產(chǎn)物減少，植物生長(zhǎng)發(fā)育受阻[2]。生物入侵已經(jīng)成為導(dǎo)致全球生物多樣性下降的一個(gè)重要因素，擴(kuò)散到新生境的入侵植物比原產(chǎn)地的個(gè)體具有更強(qiáng)的化感作用，使其在與其他種群爭(zhēng)奪環(huán)境資源的競(jìng)爭(zhēng)中獲得優(yōu)勢(shì)地位[3]。入侵植物釋放到周圍的化感物質(zhì)具有較大的細(xì)胞毒性[4]，這些物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后往往會(huì)破壞細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[5]，并干擾受體植物的基因表達(dá)[6]。入侵植物土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL.)釋放的揮發(fā)油及其主要成分α-萜品烯和對(duì)傘花素誘導(dǎo)周圍植物的根細(xì)胞[7]和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞[8]凋亡，并干擾了根尖細(xì)胞的抗氧化酶活性及其基因表達(dá)[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)是否影響與光合作用密切相關(guān)的細(xì)胞器葉綠體的結(jié)構(gòu)以及光合關(guān)鍵基因表達(dá)的研究卻鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用盆栽試驗(yàn)，以土荊芥入侵地廣泛栽培的農(nóng)作物蠶豆(ViciafabaL.)為受體，運(yùn)用透射電鏡技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，研究了土荊芥揮發(fā)油及其主要成分α-萜品烯和對(duì)傘花素對(duì)受體植物幼苗葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)和光合相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為深入探討土荊芥的入侵機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土荊芥揮發(fā)油由本實(shí)驗(yàn)室提供。色淡黃，密度843 mg/mL，其主要成分α-萜品烯和對(duì)傘花素的含量分別為151和156 mg/mL；α-萜品烯和對(duì)傘花素的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都市銳可思生化試劑公司；蠶豆種子(成胡14#)購(gòu)于成都市五塊石種子市場(chǎng)。

1.2 幼苗培養(yǎng)和化感脅迫處理

幼苗培養(yǎng)方法見本項(xiàng)目組前期研究[4]。待蠶豆幼苗長(zhǎng)至4～5周進(jìn)行化感脅迫處理；本研究共設(shè)置3個(gè)處理組(揮發(fā)油處理組、α-萜品烯處理組、對(duì)傘花素處理組)和1個(gè)對(duì)照組。在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定揮發(fā)油的處理劑量，將該處理劑量揮發(fā)油中對(duì)傘花素和α-萜品烯的含量定為二者的處理劑量；挑選長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)良好的蠶豆幼苗若干盆，隨機(jī)分為4組，分別置于特制的、帶有密封蓋子的玻璃箱(長(zhǎng)25 cm、寬20 cm、高40 cm)中，每箱均勻放置5盆，在每個(gè)箱底部正中央放置一個(gè)小培養(yǎng)皿；分別將80 μl揮發(fā)油、14.88 μl α-萜品烯和3.52 μl對(duì)傘花素滴加在玻璃箱中央的小培養(yǎng)皿中，迅速蓋上蓋子，并用凡士林封住玻璃箱口。對(duì)照組不作處理但同樣用凡士林封住玻璃箱口。將4組玻璃箱均置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中處理3 h取出揮去揮發(fā)物，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天處理時(shí)段為10:00-13:00，連續(xù)處理3 d，第4天取樣電鏡觀察和real-time PCR分析。

1.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察

取處理第4天后的葉片，在中脈兩側(cè)剪取1 mm×1 mm的小塊若干，2.5 %戊二醛前固定，0.1 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗，1 %鋨酸后固定， 0.1 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗，乙醇梯度系列脫水，丙酮︰Epon 812包埋劑=1∶1的混合液滲透，Epon-812環(huán)氧樹脂包埋，Leica UC7切片機(jī)切片，鈾鉛雙染色(2 %醋酸鈾飽和水溶液和檸檬酸鉛分別染色15min)，室溫干燥過(guò)夜。Tecnai G2 20 TWIN透射電子顯微鏡觀察并采集圖像。

1.4 葉片RNA的提取與RT-PCR分析

總RNA的提取: 取處理第4天后的葉片，用液氮充分研磨，按照天根生化科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取蠶豆幼苗葉片的總RNA，除去DNA后分裝于EP管中，-80 ℃保存待測(cè)。

引物設(shè)計(jì)：用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)蠶豆核酮糖羧化酶基因(Rbcs-3C)、光系統(tǒng)ⅡCP47蛋白基因(PsbB)、ATP合成酶β亞基基因(beta)、質(zhì)體藍(lán)素基因(PetE)和內(nèi)參基因(EF-1-alpha)特異性引物，序列如下。EF-1-alphaF：5′-ACGAGGCTCTCACTGAGGCTCTTCC-3′；EF-1-alphaR：5′-CCTTGGCAGGGTCATCCTTGGAGTTG-3′；Rbcs-3CF：5′-CCGTGAGCACAACAAGTCACCAGGAT-3′；Rbcs-3CR：5′-GGTAAGCCGCAACAACTTCATCAAGC-3′；PsbBF：5′-CCGCTCTAACAATTCCGTCTCCGTCT-3′；PsbBR：5′-CGAAGAGTTGGTGCTGGGCTAGTCAA-3′；betaF：5′-TTCTTCACCGACGATGCGAGGTTGGA-3′；betaR：5′-GACTGATCCTGCTCCTGCCACGACAT-3′；PetEF：5′-GCTGTAAGTCTCACCAGGAGCGTTGA-3′；PetER：5′-AGCAATGCCTTGGCTGTTGAAGTCTT-3′。

引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

RT-PCR分析:使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(PIKORed 96，美國(guó)Thermo Fisher)進(jìn)行RT-PCR分析。反應(yīng)體系為20 μl，含SYBR Primix ExTaqⅡ10 μl， PCR Forward Primer 0.8 μl，PCR Reverse Primer 0.8 μl，cDNA 2 μl和ddH2O 6.4 μl；熒光 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；每處理重復(fù)3次；使用Thermo Scientific PikoReal軟件分析PCR過(guò)程的CT(Threshold cycle)值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

參照Williamson et al.[10]的方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量的化感敏感指數(shù)(RI)：RI=1-C/T(T≥C);RI=T/C-1(T

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對(duì)傘花素對(duì)蠶豆幼苗葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中的蠶豆葉片葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖1 a, e, i)，葉綠體長(zhǎng)梭形，膜結(jié)構(gòu)清晰完整，排列有序，并緊貼于細(xì)胞壁，葉綠體中基質(zhì)均勻且濃密，基粒類囊體垛疊整齊緊密，淀粉粒發(fā)育正常；揮發(fā)油處理組(圖1d, h, l)中，葉綠體脫離細(xì)胞壁散亂分布于細(xì)胞中央，結(jié)構(gòu)紊亂，表現(xiàn)為腫脹、膜結(jié)構(gòu)受損明顯，葉綠體內(nèi)部基質(zhì)不均勻、基粒類囊體排列紊亂、淀粉粒消失、片層扭曲且排列松散；α-萜品烯處理組中(圖1 c, g, k)，葉綠體出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，部分葉綠體脫離細(xì)胞壁，葉綠體膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化不明顯；對(duì)傘花素處理組(圖1 b, f, j)中，葉綠體超微結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比無(wú)差異，表明對(duì)傘花素對(duì)蠶豆葉綠體超微結(jié)構(gòu)沒(méi)有產(chǎn)生影響。

a, e, i: 對(duì)照組；b, f, j: 對(duì)傘花素處理組；c, g, k: α-萜品烯處理組；d, h, l: 揮發(fā)油處理組；CH：葉綠體；SG：淀粉粒；CW：細(xì)胞壁；Me：葉綠體膜；G：基粒；GL：基粒片層；N:細(xì)胞核a, e and i are control groups；b, f and j were cymene-treated groups； c, g and k are α-terpinene-treated groups；CH is Chloroplast; SG is Starch Grain; CW is Cell Wall; ME is Chloroplast Membrane; G is Grana; GL is Grana Lamella; N is Nucleus圖1 土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對(duì)傘花素作用下蠶豆幼苗葉片超微結(jié)構(gòu)Fig.1 TEM micrographs of leave of Vicia faba exposure to the volatile oil from Chenopodium ambrosioides, α-terpinene and cymene

不同小寫字母表示P<0.05 的顯著水平Different lowercase letters indicates P<0.05圖2 土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對(duì)傘花素對(duì)蠶豆幼苗Rbcs-3C、PsbB、beta和PetE 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene on relative expression of Rbcs-3C, PsbB, beta and PetE in Vicia faba L.

2.2 土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對(duì)傘花素對(duì)蠶豆幼苗光合作用相關(guān)基因表達(dá)量的影響

RT-PCR研究表明，在土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對(duì)傘花素作用下，蠶豆幼苗光合關(guān)鍵基因的表達(dá)發(fā)生了不同程度的變化(圖2)。其中，揮發(fā)油處理組中蠶豆幼苗光合關(guān)鍵基因表達(dá)的變化幅度最大，核酮糖羧化酶基因(Rbcs-3C)、光系統(tǒng)ⅡCP47蛋白基因(PsbB)、ATP合成酶β亞基基因(beta)、質(zhì)體藍(lán)素基因(PetE)等4個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，對(duì)傘花素處理組的Rbcs-3C和PsbB的相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)，beta和PetE的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，但只有PetE相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；α-萜品烯處理組中，PsbB的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，而Rbcs-3C、beta和PetE的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。由此表明，土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)不同程度影響了受體植物光合關(guān)鍵基因的表達(dá)，無(wú)疑會(huì)干擾受體植物的光合作用過(guò)程。

從圖2-A可見，揮發(fā)油處理組和α-萜品烯處理組之間Rbcs-3C的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，但二者的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)傘花素處理組(P<0.05)；從圖2-B可知，PsbB的相對(duì)表達(dá)量在對(duì)傘花素處理組和α-萜品烯處理組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但二者與揮發(fā)油處理組之間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；3個(gè)處理組的beta相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05，圖2-C)，而PetE的相對(duì)表達(dá)量則無(wú)顯著差異(P>0.05，圖2-D)。

3種揮發(fā)物對(duì)蠶豆幼苗光合關(guān)鍵基因化感作用的綜合效應(yīng)分別為對(duì)傘花素0.525，α-萜品烯0.535，揮發(fā)油0.666，由此可見，揮發(fā)油對(duì)光合關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量影響最大，而揮發(fā)油主要成分α-萜品烯和對(duì)傘花素的化感作用強(qiáng)度不及揮發(fā)油，說(shuō)明揮發(fā)油中多種成分存在正向的協(xié)同效應(yīng)。

4種基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)土荊芥揮發(fā)油的敏感程度從大到小依次為PetE，Rbcs-3，CPsbB和beta。

3 討 論

葉綠體是植物體內(nèi)葉綠素存在的部位，是進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所[11]?；凶饔脤?duì)葉綠體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的影響將直接改變受體植物的生長(zhǎng)發(fā)育。葉綠體結(jié)構(gòu)受損時(shí)，葉綠素合成酶活性受抑制，葉綠素降解酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致葉綠素的含量下降[12]。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，在土荊芥揮發(fā)油及其兩個(gè)主要成分α-萜品烯和對(duì)傘花素作用下，蠶豆幼苗的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPsⅡ) 和葉綠素含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，土荊芥化感脅迫可能干擾了葉綠素的合成過(guò)程或引起葉綠素降解，從而降低了光合速率[13]。本研究結(jié)果表明，在土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯和對(duì)傘花素的作用下，蠶豆幼苗葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞，其中揮發(fā)油處理組中葉綠體受損程度最為嚴(yán)重，葉綠體散亂分布于細(xì)胞中央，結(jié)構(gòu)紊亂，表現(xiàn)為腫脹、膜結(jié)構(gòu)受損明顯，葉綠體內(nèi)部基質(zhì)不均勻、基粒類囊體排列紊亂、淀粉粒消失、片層扭曲且排列松散。相對(duì)而言，對(duì)傘花素對(duì)葉綠體的損害較小。由此可見，土荊芥化感脅迫抑制鄰近植物的生長(zhǎng)發(fā)育[14-15]，無(wú)疑與其化感物質(zhì)破壞了葉綠體超微結(jié)構(gòu)、影響光合作用過(guò)程有關(guān)。

化感物質(zhì)通過(guò)上調(diào)或下調(diào)某些基因，或誘導(dǎo)新基因的表達(dá)，影響受體植物相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控[16]。例如，珍珠繡線菊(SpiraeathunbergiiBl.)釋放的順式肉桂酸改變了擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)237個(gè)基因的表達(dá)量[17]，土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)下調(diào)了玉米(ZeamaysL.)抗氧化酶基因的表達(dá)[9]。光合作用涉及多個(gè)相互協(xié)調(diào)且復(fù)雜的反應(yīng)步驟，其每一步反應(yīng)均容易受到各種環(huán)境脅迫的影響[18-19]。本研究結(jié)果表明，在揮發(fā)油、α-萜品烯和對(duì)傘花素作用下，與光合作用有關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)發(fā)生了不同程度的變化。整體來(lái)看，大部分處理中，基因表達(dá)表現(xiàn)為上調(diào)，僅僅3個(gè)處理的基因表達(dá)下調(diào)(對(duì)傘花素處理組的Rbcs-3C和PsbB；α-萜品烯處理組的PsbB)。PsbB和PetE的表達(dá)產(chǎn)物是光合電子傳遞鏈的重要成員，beta的表達(dá)產(chǎn)物與葉綠體ATP的合成有關(guān)，而Rbcs-3C表達(dá)異常將直接改變受體植物的碳同化過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，土荊芥釋放到環(huán)境中的揮發(fā)性化感物質(zhì)干擾了蠶豆幼苗光合關(guān)鍵基因的正常表達(dá)，打破了蠶豆幼苗的光合作用過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)協(xié)調(diào)性，進(jìn)而影響了幼苗的正常生長(zhǎng)。

土荊芥揮發(fā)油的成分十分復(fù)雜[22]，這些成分在植物化感作用中的地位不盡相同，且可能相互之間可能存在著拮抗效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)。從本研究結(jié)果可見，揮發(fā)油對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)的損害和對(duì)光合作用關(guān)鍵基因表達(dá)的影響最大，α-萜品烯次之，對(duì)傘花素的影響最小。這一結(jié)果與本項(xiàng)目組前期的研究結(jié)果相同[7-9, 20-21]。綜合分析可知，土荊芥向周圍環(huán)境釋放的揮發(fā)性化感物質(zhì)之間存在著協(xié)同作用，進(jìn)而使揮發(fā)油的化感效應(yīng)大于其主要成分α-萜品烯和對(duì)傘花素。

4 結(jié) 論

在土荊芥揮發(fā)油、α-萜品烯、對(duì)傘花素作用下，蠶豆幼苗葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu)受損，葉綠體脫離細(xì)胞壁散亂分布于細(xì)胞中央，結(jié)構(gòu)紊亂，表現(xiàn)為腫脹、膜結(jié)構(gòu)受損明顯，葉綠體內(nèi)部基質(zhì)不均勻、基粒類囊體排列紊亂、淀粉粒消失、片層扭曲且排列松散；核酮糖羧化酶基因(Rbcs-3C)、光系統(tǒng)ⅡCP47蛋白基因(PsbB)、ATP合成酶β亞基基因(beta)、質(zhì)體藍(lán)素基因(PetE)等光合關(guān)鍵基因的表達(dá)異常。綜上所述，破壞受體植物葉綠體結(jié)構(gòu)、干擾光合作用關(guān)鍵基因表達(dá)是土荊芥化感脅迫的機(jī)制之一。