陸 堅(jiān)，路衛(wèi)衛(wèi)，李偉亮，郭曉敏，杜麗琴，韋宇拓，黃日波

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530005)

【研究意義】β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21；1.4-β-D-glucosidase)又稱為纖維二糖酶，是一類能水解烷基糖苷、芳基糖苷和纖維低聚糖等糖鏈中β-D-葡萄糖苷鍵釋放非還原性糖基的一種水解酶，是多功能酶類[1]。β-葡萄糖苷酶作為纖維素降解的限速酶，在降解纖維素生產(chǎn)燃料酒精中起著非常重要的作用[2]。然而，大部分β-葡萄糖苷酶活活力低，反應(yīng)條件(如溫度和pH值)適應(yīng)范圍相對較窄，穩(wěn)定性差，酶活性易受產(chǎn)物葡萄糖的抑制等等，制約著β-葡萄糖苷酶的廣泛應(yīng)用，成為纖維素燃料酒精行業(yè)發(fā)展的瓶頸[3-4]。此外，由于純培養(yǎng)技術(shù)局限，仍然有99 %的微生物未能實(shí)現(xiàn)人工純培養(yǎng)[5]，嚴(yán)重阻礙了微生物資源的利用和開發(fā)。宏基因組技術(shù)不依賴于微生物培養(yǎng)，以特定環(huán)境中微生物總DNA為研究對象，是一條尋找新基因及新酶的新途徑。利用宏基因組技術(shù)，通過構(gòu)建高糖土壤微生物宏基因組文庫，有望獲得新穎的纖維素酶及其基因資源，對纖維素燃料酒精行業(yè)的發(fā)展及能源短缺、環(huán)境污染問題的解決均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外對β-葡萄糖苷酶的研究主要著眼于微生物來源的β-葡萄糖苷酶。其中一個(gè)研究趨勢是通過傳統(tǒng)微生物分離純化的方法獲得高活力或具有優(yōu)良特性的β-葡萄糖苷酶，另一個(gè)研究趨勢是通過建立宏基因組文庫獲得新的β-葡萄糖苷酶基因。此外，國內(nèi)外許多研究還著眼于利用蛋白質(zhì)分子改造技術(shù)提高β-葡萄糖苷酶的活力和熱穩(wěn)定性；提高β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性，減弱反饋抑制的影響[6-12]。【本研究切入點(diǎn)】自然界中蘊(yùn)藏著巨大的微生物資源，然而，研究發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)下只有1 %的土壤微生物能分離培養(yǎng)，大量新的微生物和基因資源仍未被發(fā)現(xiàn)[13-14]。采用宏基因組技術(shù)，獲取土壤微生物總DNA，運(yùn)用基因克隆、功能篩選、基因表達(dá)等手段，避開了絕大多數(shù)微生物難以分離培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸，獲取大量未培養(yǎng)微生物的基因資源，為挖掘新基因及新型生物活性物質(zhì)開辟了新途徑[15-18]。目前，有關(guān)高糖土壤宏基因組文庫β-葡萄糖苷酶的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】提取高質(zhì)量的高糖土壤宏基因組DNA，構(gòu)建高糖土壤宏基因組文庫，獲得新型的β-葡萄糖苷酶，為進(jìn)一步獲取具有優(yōu)良性狀的β-葡萄糖苷酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土壤為采自廣西南寧市蒲廟糖紙廠常年被廢糖蜜侵染的土壤；大腸桿菌(Escherichiacoli)EPI300和載體pEpiFOS-5購自Epicentre公司，E.coliBL21 購自Stratagene 公司，載體pSE380購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、PCR 擴(kuò)增聚合酶和T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG )及各對硝基苯基底物等均購自Sigma公司；文庫構(gòu)建試劑盒購自Epicentre公司，Ni-NTA 購自Qiagen 公司，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒及膠回收試劑盒均購自BioFlux公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 宏基因組DNA文庫構(gòu)建

按照EpiFOSTMFosmid Library Production Kit試劑盒步驟進(jìn)行操作，構(gòu)建宏基因組文庫。

1.3 宏基因組文庫中β-葡萄糖苷酶活性克隆的篩選

將文庫影印到七葉苷平板上，37 ℃培養(yǎng)12～15 h，經(jīng)氯仿熏蒸破胞15 min，再在37 ℃培養(yǎng)箱顯色2 h后觀察，若菌落周圍變黑則為陽性克隆子。將篩選出來的陽性克隆子進(jìn)行培養(yǎng)、提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EPI300，涂布到七葉苷平板上，若平板上仍顯示活性，則確定該克隆子含有β-葡萄糖苷酶基因。

1.4 重組Fosmid質(zhì)粒的亞克隆

提取已驗(yàn)證的陽性克隆子的質(zhì)粒DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行DNA酶切，將已酶切的質(zhì)粒DNA與去磷酸化的經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體pUC19連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliJM109中，涂布到七葉苷平板上。37 ℃培養(yǎng)，篩選出有酶活性的亞克隆。通過質(zhì)粒提取及酶切驗(yàn)證后送交廣州華大基因公司測序。

1.5 亞克隆序列生物信息學(xué)分析

使用VECTOR NTI Advance 10軟件對已測序的DNA序列進(jìn)行拼接，采用NCBI的BlastX和BlastN工具與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對和分析。通過NCBI的在線ORF Finder工具對已測序的DNA序列進(jìn)行開放閱讀框的預(yù)測。用SMART分析氨基酸序列的組件結(jié)構(gòu)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。使用SignalP 4.1 server 進(jìn)行信號肽預(yù)測。使用MUSCLE algorithm的Jalview軟件進(jìn)行在線序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.6 β-葡萄糖苷酶基因的克隆

根據(jù)陽性亞克隆子的測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，上游引物unbgl3A-1：5’-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACCAAAGCTCCACTTCGTTAAAG-3’ (引入PagⅠ酶切位點(diǎn)和6×His tag)，下游引物unbgl3A-2：5’-CCCGAATTCTTATTCCACAACGAAAGA ACC -3’(引入EcoR I酶切位點(diǎn))。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以pUC-unbgl3A質(zhì)粒為模板，采用Prime STAR HS DNA 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A。用小量PCR純化試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行PagI和EcoR I酶切，與經(jīng)NcoI和EcoR I酶切的表達(dá)載體pSE380連接，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中，篩選陽性克隆子進(jìn)行測序。將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pSE-unbgl3A。

1.7 重組酶UNBGL3A的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

把已驗(yàn)證正確的具有β-葡萄糖苷酶活性的重組菌株接種到LB(含100 μg/mL Amp)中， 37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為 1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)10 h后，收集菌體，超聲波破胞后鎳親和層析Ni-NTA 純化重組酶Unbgl3A。

1.8 重組酶Unbgl3A酶學(xué)性質(zhì)分析

(1)β-葡萄糖苷酶酶活力單位(U)的定義：在酶的最適反應(yīng)條件下，每分鐘水解p-NPG 釋放1 μmolpNP 所需的酶量為一個(gè)單位。

(2)β-葡萄糖苷酶的酶活力測定方法：取14 μlp-NPG(25 mmol/L)溶液和116 μl最適pH值的緩沖液混合，最適溫度下預(yù)熱10 min，加入10 μl稀釋適當(dāng)倍數(shù)的純酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)15 min后，立即加入70 μl 0.4 mmol/L的Na2CO3終止反應(yīng)并顯色。取200 μl上述反應(yīng)液加到96孔板中，用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液的OD410(以加入10 μl已失活的酶液作為空白對照)。

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，參照Bradford法[19]來測定純化的蛋白質(zhì)濃度。

(3)β-葡萄糖苷酶的最適pH值測定：按照酶活測定方法，37 ℃下，在一系列pH的緩沖液中測定 pH對酶的活力的影響。以最高活力為100 %計(jì)算各pH下該酶的相對活力，相對活力最高的pH即為該酶的最適pH值。

(4)β-葡萄糖苷酶的pH 穩(wěn)定性的測定：將純酶保存在不同pH(3.0～9.0)的緩沖溶液中，4 ℃放置12 h。然后按照酶活測定方法，在最適反應(yīng)條件下測定殘余的酶活力。以最高活力作為100 %，計(jì)算各個(gè)pH 值下該酶的相對活力。

(5)β-葡萄糖苷酶的最適溫度測定：按照酶活測定方法，在酶的最適pH條件下測定不同溫度條件下β-葡萄糖苷酶的活力，并以最高活力100 %計(jì)算各個(gè)溫度下該酶的相對活力，相對活力最高的溫度就是該酶的最適作用溫度。

(6)β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性的測定：將酶液在一系列不同的溫度下中保溫1 h，在該酶的最適反應(yīng)條件下測定殘余的酶活力。將4 ℃保存的酶液活力視為100 %，依此計(jì)算各個(gè)溫度下酶液的相對活力。

(7)β-葡萄糖苷酶的Km和Vmax測定：在最適溫度、最適pH的條件下測定不同底物濃度中的β-葡萄糖苷酶的活力，并利用Lineweaver-Burk作圖法計(jì)算得到酶的Km和Vmax值。

(8)不同糖類對β-葡萄糖苷酶酶活力的影響：在最適作用條件下，在標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)體系中分別加入終濃度為5 %～20 %(W/V)的果糖、阿拉伯糖、半乳糖、麥芽糖和蔗糖，測定β-葡萄糖苷酶以p-NPG為底物的酶活力。以不添加上述物質(zhì)的酶活力為100 %，計(jì)算上述各種單糖和雙糖在不同濃度下對β-葡萄糖苷酶活力影響。

(9)β-葡萄糖苷酶底物特性分析：在最適作用條件下，以對硝基苯基-β-D-半乳糖苷、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、對硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷、對硝基苯基-β-D-纖維二糖糖苷、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)以及纖維二糖、乳糖、麥芽糖為底物進(jìn)行特異性的活力測定分析。將底物分別為p-NPG和纖維二糖的酶活力視為100 %。

(10)葡萄糖對β-葡萄糖苷酶抑制性質(zhì)的研究：以2.5 mmol/Lp-NPG為底物，在最適溫度及最適pH條件下加入不同濃度葡萄糖測定酶活力。不添加葡萄糖的酶活力視為100 %，依此確定葡萄糖對β-葡萄糖苷酶的活力影響。

(11)β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物的HPLC定性檢測：分別以10 %纖維二糖和10 %葡萄糖為底物加入適量的β-葡萄糖苷酶在最適pH，37 ℃作用48 h，反應(yīng)結(jié)束后放置沸水中10 min終止反應(yīng)，室溫冷卻后用高效液相色譜儀(HPLC)，檢測其反應(yīng)終產(chǎn)物。以各種糖為標(biāo)準(zhǔn)樣，反應(yīng)樣品中出峰時(shí)間與某標(biāo)準(zhǔn)樣一致的可認(rèn)為是該種糖。

HPLC工作條件：Agilent 1100 Series檢測儀，Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器；流動相：乙腈∶雙蒸水=75∶25；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μl；柱溫28 ℃。

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖土壤宏基因組文庫構(gòu)建及質(zhì)量評估

從高糖土壤中提取的DNA經(jīng)純化后，其大小和純度滿足構(gòu)建Fosmid文庫要求。而后進(jìn)行補(bǔ)平回收、連接和侵染E.coliEPI300，構(gòu)建一個(gè)高糖土壤宏基因組文庫，文庫共有320塊平板，以每塊平板菌落總數(shù)為290計(jì)(隨機(jī)取10塊平板進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，平均每塊平板菌落總數(shù)為293個(gè))，構(gòu)建了約含9.2萬個(gè)克隆的Fosmid文庫。

M：λ/HindIII DNA 標(biāo)記；1～12：質(zhì)粒 BamHI酶切產(chǎn)物M: λ/HindIII DNA Marker; 1-12: Fosmids digested with BamHI圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析宏基因組文庫質(zhì)粒的BamHI酶切產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of plasmids from metagenomic Fosmid library digested with BamHI

隨機(jī)挑取Fosmid文庫中的12 個(gè)克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行BamHI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，如圖1 所示，12個(gè)質(zhì)粒均含有7.5 kb載體條帶，而且酶切帶型絕大部分不相同，證明插入片段的隨機(jī)性良好。其中插入的外源DNA 片段大小均分布在25～44 kb之間，估算平均插入片段的大小約為34 kb，文庫含外源DNA 總量約為為3.1×109bp。

2.2 宏基因組文庫中β-葡萄糖苷酶活性克隆子的篩選

采用平板影印方法把文庫影印到七葉苷篩選平板，經(jīng)過37 ℃過夜培養(yǎng)后進(jìn)行顏色觀察，共篩選到

了11個(gè)表達(dá)β-葡萄糖苷酶活性的克隆。圖2-A是其中一個(gè)能在七葉苷篩選平板上表達(dá)活性的克隆，而后將其進(jìn)一步分離純化(圖2-B)。

2.3 測序及生物信息學(xué)分析

2.3.1unbgl3A基因的獲取和序列分析 挑選文庫中高效表達(dá)β-葡萄糖苷酶活性的克隆子進(jìn)行亞克隆，得到含有5.3 kb外源片段的具有β-葡萄糖苷酶活性的亞克隆，經(jīng)測序后用NCBI的ORF Finder工具預(yù)測該DNA序列，得到一個(gè)編碼β-葡萄糖苷酶基因的開放閱讀框，命名為unbgl3A。

unbgl3A基因開放閱讀框 (Open reading frame，ORF)由2241個(gè)核苷酸組成，用megablast (Highly similar sequences)軟件比較，在DNA水平上，該序列在GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫未發(fā)現(xiàn)任何的同源基因；而經(jīng)用Blastx軟件檢索GenBank氨基酸數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的產(chǎn)物與來自擬桿菌屬Bacteroidessp. D20的β-葡萄糖苷酶同源性最高(一致性73 %，相似性85 %)。Unbgl3A蛋白由747個(gè)氨基酸組成，屬于糖基水解酶家族3。相對分子量為80271.2；用SMART工具(Simple Modular Architecture Research Tool)對該基因編碼的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示該β-葡萄糖苷酶自N端的第 1～18位氨基酸為信號肽，自N端的第89～313位氨基酸為糖基水解家族3功能域，第367～378位氨基酸為糖基水解家族3C功能域。

2.3.2 Unbgl3A的進(jìn)化分析 將Unbgl3A和10個(gè)糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶蛋白質(zhì)序列進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖3)表明，Unbgl3A與擬桿菌屬中的Bacteroidesuniformis和BacteroidesfluxusYIT 12057的β-葡萄糖苷酶親緣關(guān)系較近，與其他來源的β-葡萄糖苷酶親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。

A：影印平板上產(chǎn)生黑圈的克隆子；B：陽性克隆子的純化A: Clone producing black in the selective plate; B: Purification of the positive clone圖2 Fosmid文庫中陽性克隆子篩選Fig.2 The screening of positive clones of fosmid library

蛋白質(zhì)序列和微生物來源如下：Bfl β-葡糖苷酶(ZP 08299052)來源擬桿菌菌種YIT 12057；Bun β-葡萄糖苷酶(EIY73262)來源單形擬桿菌；Dmo β-葡糖苷酶(ZP 08468536)來源莫氏八角單胞菌 DSM；Fba β-葡萄糖苷酶(ZP 09315898)來源黃桿菌細(xì)菌HQM9；Sus β-葡萄糖苷酶(YP 828134)來源Solibacter usitatus；Swo β-葡糖苷酶(YP 001762714)來源雪旺氏菌ATCC 51908；Lbl β-葡萄糖苷酶(ZP 01060241)來源Leeuwenhoekiella blandensis MED217；Sal β-葡萄糖苷酶(YP 616064)來源鞘氨醇單胞菌RB2256；Pla β-葡糖苷酶(ZP 09002363)來源乳酸芽孢桿菌154；The β-葡萄糖苷酶(ABI 29899)來源新阿波羅棲熱袍菌 DSM 4359The sequences were identified as follows: Bfl β-glucosidase from Bacteroides fluxus YIT 12057(ZP 08299052); Bun β-glucosidase from Bacteroides uniformis (EIY73262); Dmo β-glucosidase from Dysgonomonas mossii DSM (ZP 08468536); Fba Flavobacteriaceae bacterium HQM9 (ZP 09315898); Sus β-glucosidase from Solibacter usitatus (YP 828134); Swo β-glucosidase from Shewanella woodyi ATCC 51908 (YP 001762714); Lbl β-glucosidase from Leeuwenhoekiella blandensis MED217 (ZP 01060241); Sal β-glucosidase from Sphingopyxis alaskensis RB2256(YP 616064); Pla β-glucosidase from Paenibacillus lactis 154 (ZP 09002363)I44874); Tne β-glucosidase from Thermotoga neapolitana DSM 4359 (ABI 29899)圖3 Unbgl3A進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Unbgl3A

2.4 unbgl3A基因的克隆

以含有unbgl3A基因的pUC19質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出一條大約為2.3 kb的DNA條帶。該DNA條帶大小與預(yù)期的unbgl3A基因大小相符。

2.5 重組酶UNBGL3A的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒pSE-unbgl3A轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞E.coliBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用鎳離子親和層析柱對重組蛋白Unbgl3A純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，在約為80 kD處有明顯的蛋白質(zhì)特征性條帶，其分子量與理論計(jì)算分子量相符，表明unbgl3A基因成功表達(dá)，可以進(jìn)行酶學(xué)特性分析(圖4)。

1：E. coli BL21/pSE380 誘導(dǎo)菌體的裂解物；2：E.coli BL21/pSE-Unbgl3A 誘導(dǎo)菌體的裂解物；3：純化的Unbgl3A；M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白1: Induced cell lysate of E.coli BL21/pSE380; 2: Induced cell lysate of E.coli BL21/pSE-unbgl3A; 3:Purified Unbgl3A; M: Standard protein marker圖4 Unbgl3A表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of Unbgl3A

2.6 重組蛋白UNBGL3A酶學(xué)特性分析

2.6.1 溫度和pH 對Unbgl3A 的影響 在37 ℃條件下，分別測定Unbgl3A在不同pH(3.6～8.0)下的酶活力。重組Unbgl3A的最適作用pH值為6.0。在pH 5.0～7.0時(shí)保留70 %以上酶活力，pH值在5.0 以下和7.0以上酶活力急劇下降，在pH值小于4.5或大于7.5時(shí)只有不到20 %的相對活力(圖5-A)。將純酶保存在不同pH(3.0～9.0)緩沖液中， 4 ℃下放置12 h，在最適反應(yīng)條件下測定Unbgl3A的殘余酶活力，結(jié)果表明酶在pH 6.0～9.0時(shí)較為穩(wěn)定，在4 ℃條件放置12 h 仍保持70 %以上的酶活力，在pH 9.0 更是保持90 %以上的酶活力(圖5-B)。由此可見，該酶在偏堿性條件下較為穩(wěn)定。在最適pH條件下(檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，pH 6.0)分別測定Unbgl3A在25～70 ℃的不同溫度條件下的酶活力，結(jié)果表明Unbgl3A的最適溫度為50 ℃，在溫度35～50 ℃時(shí)，重組Unbgl3A保持相對比較高的活力(>70 %)，溫度超過50 ℃后，酶活力急劇下降(圖5-C)。將純化的重組酶在15～60 ℃溫育1 h后在最適合條件下測定Unbgl3A 的殘余活力，以在4 ℃ 保存的重組酶的酶活為對照，結(jié)果表明重組U nbgl3A在低于50 ℃時(shí)可保持有約90 %的相對酶活力，50 ℃以上其酶活急劇下降，60 ℃保溫1 h后酶活力幾乎完全喪失(圖5-D)。

A：pH對Unbgl3A活力的影響；B：pH對Unbgl3A穩(wěn)定性的影響；C：溫度對Unbgl3A活力的影響；D：溫度對Unbgl3A穩(wěn)定性的影響A: Effect of pH on Unbgl3A enzyme activity; B: pH stability of Unbgl3A; C: Effects of temperature on Unbgl3A enzyme activity;D: Thermal stability of Unbgl3A圖5 pH和溫度對Unbgl3A活力的影響Fig.5 Effects of pH and temperature on the activity of Unbgl3A

2.6.2 Unbgl3A的酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km和Vmax測定 在酶反應(yīng)最適溫度和最適pH條件下測定Unbgl3A在0.5～8.0 mM的p-NPG濃度中的酶活力。通過與酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V對底物濃度的倒數(shù)1/[S]作圖，即Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。X和Y軸上的截距分別代表酶的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vmax)的倒數(shù)。計(jì)算出Km值為6.45 mM，Vmax為50 μmol/(mg·min)。

2.6.3 不同糖類對重組Unbgl3A的酶活力的影響 在最適作用條件下，在標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)體系中分別加入5 %～20 %(w/v)的果糖、阿拉伯糖、半乳糖、麥芽糖和蔗糖，測定上述各種單糖和雙糖對重組Unbgl3A的酶活力影響。阿拉伯糖、果糖、半乳糖和蔗糖對Unbgl3A有激活作用，而麥芽糖對重組Unbgl3A酶活力有抑制作用(圖6-A)。

A：阿拉伯糖、果糖、麥芽糖、半乳糖和蔗糖對Unbgl3A活力的影響；B：葡萄糖對Unbgl3A活力的影響A: Effect of arabinose, fructose, maltose, galactose and sucrose on Unbgl3A enzyme activity; B: Effect of glucose on Unbgl3A enzyme activity圖6 阿拉伯糖、果糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖和葡萄糖對Unbgl3A活力的影響Fig.6 Effect of arabinose, fructose, maltose, galactose, sucrose and glucose on Unbgl3A enzyme activity

底物Substrate 糖苷鍵Linkage of Glycosyl group相對水解活力(%)Relative initial rate of hydrolysis糖類(2 mg/mL) Saccharides 纖維二糖 Cellobioseβ-(1-4)Glc100乳糖 Lactoseβ-(1-4)Gal5.8±0.91麥芽糖 Maltoseα-(1-4)Glc5.7±0.84芳基糖苷(2.5 mM)Aryl-glycosides 對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 p-NPGβGlc100對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷 p-NP-α-D-glucopyranosideαGlc2±0.32對硝基苯基-β-D-纖維二糖糖苷 p-NP-β-D-cellobiosideβCel44.1±0.97對硝基苯基-β-D-半乳糖苷 p-NP-β-D-galactopyranosideβGal2.3±0.41對硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷 p-NP-β-D-xylopyranosideβxyl3.0±0.53

蔗糖對重組Unbgl3A酶活力有激活作用，隨著蔗糖濃度的增大蔗糖的激活作用提高。15 %的蔗糖激活作用最大，使Unbgl3A的酶活力提高70 %；加入5 %～20 %(w/v)的阿拉伯糖對重組Unbgl3A酶活力有激活作用，激活作用隨著阿拉伯糖濃度的增大而減弱，其中加入5 %的阿拉伯糖時(shí)重組Unbgl3A的酶活力提高最顯著，提高了35 %；低濃度半乳糖和果糖對重組Unbgl3A的酶活力有激活作用，其中5 %的半乳糖對重組Unbgl3A的酶活力提高20 %，5 %的果糖對重組Unbgl3A的酶活力分別提高5 %。隨著半乳糖和果糖濃度增加，激活作用逐漸減弱，直至最后抑制重組Unbgl3A酶活力。

2.6.4 葡萄糖對Unbgl3A抑制性質(zhì)的研究 取純化的Unbgl3A與不同濃度的pH 值為5.6葡萄糖溶液50 ℃作用15 min后，p-NPG法測定不同濃度的pH 5.6葡萄糖溶液對Unbgl3A的酶活力影響(圖6-B)。從圖6-B中可以看出葡萄糖對Unbgl3A的抑制作用較強(qiáng)。濃度為15 mM時(shí)，Unbgl3A的酶活力降低了45 %，隨后酶活力下降逐漸趨緩。

2.6.5 Unbgl3A底物特異性研究 在最適作用條件下，以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、對硝基苯基-β-D-半乳糖苷、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、對硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷、對硝基苯基-β-D-纖維二糖糖苷和纖維二糖、乳糖、麥芽糖為底物測定重組Unbgl3A的酶活力，了解重組Unbgl3A的底物特異性。結(jié)果表明，p-NPG和纖維二糖是Unbgl3A的最適底物；Unbgl3A能很好水解以β(1-4)糖苷鍵連接的纖維二糖、p-NPG和p-NPC，而對其他以β(1-4)和α(1-4)糖苷鍵連接的低聚糖的水解作用比較弱(表1)。

2.6.6 Unbgl3A的轉(zhuǎn)糖苷作用 將純化的重組Unbgl3A分別與10 %葡萄糖和10 %纖維二糖在pH 7.0、50 ℃條件下反應(yīng)48 h。同時(shí)分別加同等量的已滅活的重組Unbgl3A到10 %葡萄糖和10 %纖維二糖，作為對照。反應(yīng)完成后煮沸20 min，離心取上清采用高效液相色譜進(jìn)行產(chǎn)物檢測分析。結(jié)果顯示，重組Unbgl3A能夠水解纖維二糖生成葡萄糖，終產(chǎn)物中檢出微量低聚糖(如纖維三糖)(圖7)，以葡萄糖為受體則有很微量二糖產(chǎn)生(圖8)。

A: 葡萄糖標(biāo)樣液；B：纖維三糖標(biāo)樣；C：纖維二糖對照水解產(chǎn)物；D：Unbgl3A的纖維二糖水解產(chǎn)物A: Standard glucose; B: Standard cellotriose; C: Hydrolysis products of control; D: Hydrolysis products of cellobiose by Unbgl3A圖7 纖維二糖水解產(chǎn)物高效液相色譜分析Fig.7 HPLC analysis of the hydrolysis products of cellobiose by Unbgl3A

A：對照轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物；B：Unbgl3A的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物A: Transglycosylation products of control; B: Transglycosylation products by Unbgl3A圖8 Unbgl3A的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物高效液相色譜分析Fig.8 HPLC analysis of the transglycosylation products of Unbgl3A

3 討 論

土壤中含有極其豐富的微生物，是工業(yè)酶類和小分子藥物的重要來源。然而由于純培養(yǎng)技術(shù)局限，仍然有99 %的微生物未能實(shí)現(xiàn)人工純培養(yǎng)。這嚴(yán)重阻礙了人類對微生物資源的利用和開發(fā)。宏基因組技術(shù)以特定環(huán)境中微生物總DNA為研究對象，繞開了微生物純培養(yǎng)，解決未培養(yǎng)微生物不易分離純化的難題，是一條尋找新基因及新酶的新途徑。Elisangela等[20]從桉樹枯枝落葉的土壤宏基因組文庫中獲得β-葡糖苷酶Bg10，產(chǎn)物葡萄糖對該酶有激活作用；在50和100 mM葡萄糖中，Bg10活性分別增加了36.8 %和22 %。Bg10能夠在1 h內(nèi)完全水解40mM的纖維二糖，并且耐受乙醇至500 mM的濃度(86 %的活性)，而乙醇濃度為1M仍然保留41 %的殘余活性。Gruninger等[21]從奶牛瘤胃內(nèi)含物的宏基因組文庫中鑒定了一個(gè)多功能的GH3 家族β-葡萄糖苷酶Bgxa1，該酶能夠水解pNPG、纖維二糖、pNPX(對硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷)以及pNPAf(對硝基苯基-α-D-阿拉伯呋喃糖苷)。本研究團(tuán)隊(duì)采集廣西南寧市蒲廟糖紙廠常年被廢糖蜜侵染的土壤作為研究樣品，成功構(gòu)建了高糖土壤宏基因組文庫，獲得兩個(gè)編碼β-葡萄糖苷酶基因Unbgl3A和Unbgl3B[22]。本研究對其中的β-葡萄糖苷酶基因Unbgl3A進(jìn)一步深入探索，結(jié)果表明該基因是一個(gè)新型的β-葡萄糖苷酶基因，與數(shù)據(jù)庫中已知的β-葡萄糖苷酶基因相似性較低，而且該酶具有一些新特性，如：Unbgl3A耐受多種單糖和雙糖并被多種單糖和雙糖激活，15 %蔗糖可以提高酶活力170 %。Krisch等[23]從米黑根毛霉Rhizomucormiehei中得到的β-葡萄糖苷酶在15 %蔗糖中，酶活力提高到160 %，Chandra和Kalra[24]從桔綠木霉Trichodermacitrinoviride得到的β-葡萄糖苷酶則在蔗糖濃度為5 mM時(shí)酶活力被降低20 %。Jimenez等[25]同時(shí)做了不同濃度的阿拉伯糖、半乳糖、果糖、木糖和乳糖對來源于米黑根毛霉Rhizomucormiehei的β-葡萄糖苷酶的酶活力的影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：只有蔗糖和果糖有激活作用，5 %果糖提高酶活力15 %。而本研究中5 %阿拉伯糖、半乳糖、果糖和乳糖分別使Unbgl3A酶活力提高35 %、20 %、10 %和10 %。Unbgl3A這種耐受多種高濃度單糖和雙糖而且酶活力被多種單糖和雙糖激活的特性推測這些單糖和雙糖在反應(yīng)中作為受體，接受p-NPG釋放的葡萄糖。國內(nèi)外許多研究表明不依賴微生物可培養(yǎng)性的宏基因組文庫技術(shù)是獲取新特異性酶的有效手段[26-28]。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了約9.2萬個(gè)克隆的高糖土壤宏基因組文庫，通過活性篩選得到11個(gè)含有β-葡萄糖苷酶的克隆子，將其中一個(gè)克隆進(jìn)行亞克隆，獲得β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A，其編碼的蛋白質(zhì)序列與已知的β-葡萄糖苷酶相似性低，具有一定的新穎性。該酶具有中溫條件下穩(wěn)定的特性，在50 ℃以下保存1 h，酶活力仍保持90 %的酶殘余活力。Unbgl3A是一個(gè)耐受多種單糖和雙糖并被多種單糖和雙糖激活的β-葡萄糖苷酶，在低濃度下，乳糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖和蔗糖對Unbgl3A有激活作用，特別是蔗糖對它有顯著的激活作用，15 %蔗糖可以使酶活力提高170 %。該酶具有一定的轉(zhuǎn)糖苷功能。