成永麗，陳 健，楊 琳，楊 凡，雷夢成，傅 琴，周毅峰，唐巧玉

(1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北民族學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

【研究意義】根瘤菌(Rhizobia)，是一類存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌[1]。其能夠侵染豆科植物的根部或莖部，形成根瘤，并將空氣中的氮氣還原成氨類物質(zhì)為豆科植物的生長提供氮素營養(yǎng)，而根瘤菌需要的能源和碳源則來源于其宿主植物。二者結(jié)合的共生體系具有高效、無污染的特性，研究和開發(fā)利用這一固氮體系具有巨大的生態(tài)、經(jīng)濟和社會價值。盡管根瘤菌可能有共同的祖先，但是由于在長期進化過程中，受宿主選擇和環(huán)境的影響，分別向不同方向進化，形成了豐富的生物多樣性，其多樣性的研究成為目前生物固氮的熱點領(lǐng)域[2]?！厩叭搜芯窟M展】根瘤菌遺傳多樣性是指種群間和個體間的遺傳變異，在多樣性基礎(chǔ)上，測定各遺傳群的代表菌株的保守基因16S rDNA序列，從而確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位[3]。在各種分子標記技術(shù)中，16S rDNA由于具有信息量大、保守性強、普遍性及檢測快速簡便的特征被稱為“分子進化鐘”，同時被作為系統(tǒng)分類最合適的指標[4]，是構(gòu)建細菌系統(tǒng)發(fā)育樹的基石。研究慢生根瘤菌發(fā)現(xiàn)，其表型和遺傳特性等方面存在明顯的差異，而各個菌株間16S rDNA基因序列的差異表現(xiàn)較小[5]。因此，16S rDNA的基因序列分析是根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育和分類研究的重要手段。豆科(Leguminosae)屬于被子植物的第三大科，包括含羞草亞科、云實亞科和蝶形花亞科，分布范圍廣[6]。目前，全世界已知的豆科植物約750余屬19 000多個種，我國約185屬1500余種，并且還有許多豆科植物在不斷的被收錄和記載[7]。而黃芪屬植物多為富硒植物(如紫云英)[8]，同時大豆也為富硒植物[9]。湖北恩施州地處武陵山區(qū)，其海拔落差大，小氣候特征明顯，垂直差異突出，物種資源豐富。境內(nèi)蘊藏有獨立的硒礦床，被譽為“世界硒都”，是我國迄今發(fā)現(xiàn)的第一個富硒區(qū)。【本研究切入點】本研究通過16S rDNA基因全序列分析，分別對湖北恩施富硒地帶的竹山紫云英根瘤菌、煉鐵灣紫云英根瘤菌、漁塘壩紫云英根瘤菌、曾家紫云英根瘤菌以及低Se大豆根瘤菌和高Se大豆根瘤菌進行了分離鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討它們的親緣及進化關(guān)系，并初步探索了其耐硒能力，對豐富根瘤菌資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

6個植物樣品來源：4 株紫云英(Astragalussmicus)來源于四個不同富硒地點，分別為湖北宣恩縣椿木營鄉(xiāng)挖斷山村、湖北恩施市新塘鄉(xiāng)雙河煉鐵灣、湖北恩施市新塘鄉(xiāng)雙河漁塘壩和湖北宣恩縣椿木營鄉(xiāng)挖斷山村曾家；低Se大豆(Glycinemax)盆栽種植于低硒普通土壤；高Se大豆盆栽種植于采自湖北恩施漁塘壩的富硒土壤中。

克隆載體：pMD19-T；感受態(tài)細胞：E.coliDH5α。

1.2 設(shè)備與藥品

1.2.1 主要藥品 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氫氧化鈉、乙酸鈉、亞硒酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯仿、苯酚、異戊醇、異丙醇、氯化鈉、無水乙醇、葡萄糖、溴化乙錠、瓊脂粉，氯化鈣，磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、甘露醇、硼酸等。

EasyTaqBuffer、EasyTaq酶(TaKaRa)、dNTPs、ddH2O、P1、P6、SolutionⅠ、pMD19-T、X-gal、IPTG、氨芐青霉素、6×Loading Buffer、SalⅠ酶(TaKaRa)、BamHⅠ酶(Thermo Scientific)、10×Buffer Tango 、RV-M、M13-47、Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker。

1.2.2 培養(yǎng)基 YMA培養(yǎng)基：用于根瘤菌的培養(yǎng)。甘露醇 5.0 g；K2HPO4·3H2O 0.25 g；MgSO4·7H2O 0.1g；酵母粉 0.5 g；NaCl 0.05 g；CaCl20.025 g；Rh微量元素 2 mL，ddH2O補齊至500 mL。沸五次，冷卻至55 ℃左右調(diào)pH至6.8～7.0，分裝，高溫高壓滅菌。固體培養(yǎng)基則在YMA液體培養(yǎng)基中多加入6.5 g的瓊脂粉。

LB培養(yǎng)基：用于大腸桿菌的培養(yǎng)。胰化蛋白胨 10 g；酵母粉 5 g；NaCl 10 g；pH 7.0，ddH2O定容至1 L。LB固體培養(yǎng)基則在1 L的LB液體培養(yǎng)基中加入15 g的瓊脂粉。

培養(yǎng)基用去離子水配制后，121 ℃滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 根瘤菌的分離、純化 選取個大而飽滿的根瘤，用剪刀將其剪下(帶部分根)，將根瘤放在清水中浸泡4～5 min，洗去雜質(zhì)，再用95 %酒精浸泡5 min后，用0.1 %的升汞表面滅菌5 min，然后用無菌水沖洗6次。無菌操作下，將單個根瘤用灼燒冷卻后的解剖刀切成兩半，切面在YMA培養(yǎng)基平板上劃線，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d左右后，選擇較典型的單一菌落分別在YAM平板上劃線，繼續(xù)培養(yǎng)觀察，如果菌落無異常，再劃線稀釋反復(fù)分離，直到純化為止。

1.3.2 根瘤菌16S rDNA克隆 目的基因擴增。CTAB法提取細菌總DNA[10]。擴增引物用來源于E.coli16S rRNA基因序列保守區(qū)域的序列合成引物P1(正向引物P1：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3′)和P6(反向引物P6：5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3′)[13]。

PCR擴增體系： ddH2O 18.3 μl，10×Buffer 2.5 μl，dNTPs 2.0 μl，P10.5 μl，P60.5 μl，模板1.0 μl，Pfu酶0.2 μl，總體系25 μl。加入以上體系后，漩渦混勻，最后離心5 s左右。

M.Marker，1.竹山，2.煉鐵灣，3.漁塘壩，4.低硒，5.高硒，6.曾家;A.菌株基因組DNA，B.16S rDNA序列擴增M.Marker,1.Zhushan,2.Liantiewan,3.Yutangba,4.Dixi,5.Gaoxi,6.Zengjia;A.Genome DNA of rhizobium, B.16S rDNA sequence amplification 圖1 菌株基因組DNA和16S rDNA擴增Fig.1 The genomic DNA and 16S rDNA sequence electro-photogram of strain

PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30個循環(huán)；72 ℃最終延伸6 min；4 ℃保持，最后電泳檢測結(jié)果。

目的基因克隆測序。將目的基因連接到克隆載體pMD19-T上，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。重組子的篩選與鑒定采用IPTG/X-Gal平板法、菌落PCR篩選法和雙酶切法。其中菌落PCR所用的引物則是通用引物M13-47和RV-M，SalⅠ和BamHⅠ對重組質(zhì)粒雙酶切篩選。將所篩選的6個陽性克隆質(zhì)粒送武漢伯爾生物科技有限公司進行雙向測序。

1.3.3 分子系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 利用Vector NTI 11.5.1 軟件中去除P1、P6引物序列，結(jié)代表性根瘤菌菌株的16S rDNA序列，應(yīng)用Mega7.0生物軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 根瘤菌耐硒能力分析 竹山、煉鐵灣、漁塘壩紫云英根瘤菌分別在硒濃度為1～8 μg/mL的平板上劃線培養(yǎng)，低Se、高Se大豆根瘤菌和曾家紫云英根瘤菌則分別在硒濃度為0.1～6 μg/mL的平板上劃線培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴增

對不同地區(qū)的根瘤菌進行總DNA的提取，并進行16S rDNA序列擴增，從圖1可以看出，經(jīng)RNase酶消化后的DNA條帶清晰，大小在8000 bp以上。16S rDNA序列擴增條帶大小在1500 bp左右。與所查文獻相一致。

2.2 16S rDNA克隆檢測

2.2.1 菌落PCR檢測 將16S rDNA序列擴增產(chǎn)物與pMD-19T連接，熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞于含有IPTG、X-gal 的LB平板中培養(yǎng)，挑取平板中的白色陽性克隆菌落進行菌落PCR鑒定，結(jié)果見圖2～3。在平板上轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒生長較好，無雜菌污染，且菌落大多呈白色，也有少量的藍色菌落，說明轉(zhuǎn)化效率較高，轉(zhuǎn)化成功。菌落PCR檢測出了6個包含單一條帶的陽性克隆。

2.2.2 酶切鑒定 為進一步確定陽性克隆，堿提法抽提6個菌落PCR陽性克隆的質(zhì)粒，用SalⅠ和BamHⅠ進行酶切鑒定，由于2種酶來自不同的公司，故用通用Buffer(Tango Buffer)進行酶切，結(jié)果見圖4B。6個菌落質(zhì)粒抽提圖譜(圖4A)，有3條帶呈現(xiàn)，因為質(zhì)粒存在3種形態(tài)，即超螺旋、開環(huán)、線性，說明抽提效果較好，都可以用于測序分析。

2.3 6種根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

將6個陽性克隆質(zhì)粒送往武漢伯爾生物科技有限公司進行雙向測序，通過Vector NTI軟件進行序列拼接，去除載體序列和16S rDNA引物，得到的片段長度均為1390 bp左右。

M.Marker，1.竹山，2.煉鐵灣，3.漁塘壩，4.低硒，5.高硒，6.曾家M.Marker,1.Zhushan,2.Liantiewan,3.Yutangba,4.Dixi,5.Gaoxi,6.Zengjia圖2 菌落PCR檢測Fig.2 Colony PCR detection

A. 竹山；B. 煉鐵灣；C. 漁塘壩；D. 低硒；E. 高硒；F. 曾家A.Zhushan; B.Liantiewan; C.Yutangba; D.Dixi; E.Gaoxi; F.Zengjia圖3 重組子轉(zhuǎn)化Fig.3 Recombinant transformation

A.質(zhì)粒DNA，B.酶切鑒定；M-Marker，1.竹山，2.煉鐵灣，3.漁塘壩，4.低硒，5.高硒，6.曾家 A.Plasmid DNA, B.Enzyme digestion identification；M.Marker,1.Zhushan,2.Liantiewan,3.Yutangba,4.Dixi,5.Gaoxi,6.Zengjia)圖4 質(zhì)粒DNA和酶切鑒定Fig.4 Plasmid DNA and enzyme digestion identification

根據(jù)根瘤菌的分類，在NCBI查找相應(yīng)的種屬序列，采用Neighbour-Joining 模型，確定分離出的6種根瘤菌的分類地位，結(jié)果見圖5。竹山、煉鐵灣、漁塘壩紫云英根瘤菌供試菌株歸屬土壤桿菌屬(Agrobacterium)、低硒大豆根瘤菌供試菌株歸屬慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、高硒大豆根瘤菌供試菌株歸屬中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、曾家紫云英根瘤菌供試菌株歸屬根瘤菌屬(Rhizobium)。

2.4 6種根瘤菌的耐硒濃度

竹山、煉鐵灣、漁塘壩、曾家紫云英根瘤菌在不同硒濃度下培養(yǎng)40 h，其耐硒能力分別為6、6、6、6、5 μg/mL，而低硒、高硒大豆根瘤菌分別培養(yǎng)4 d+2 h、2 d+16 h，其耐硒能力均為3 μg/mL(圖6～11)。

3 討 論

生物固氮占全球植物所需氮素的75 %, 而在生物固氮體系中, 限于豆科植物的共生固氮體系效率最高，豆科植物-根瘤菌固氮系統(tǒng)每年固定約5 000萬噸的氮營養(yǎng)[11]。因此，研究人員不斷地研究根瘤菌的多樣性及生活習(xí)性等方面，發(fā)現(xiàn)了越來越多的新種：從1932 年的1 屬6 種，增加到現(xiàn)在的17 屬近100 種[12]；而且新的根瘤菌物種還在不斷地被發(fā)現(xiàn)，而本文從不同樣本中分離得到的根瘤菌歸屬于已有的不同屬別，對于其種的鑒別還需系一部進行。與大豆結(jié)瘤的根瘤菌主要是慢生根瘤菌屬和中華根瘤菌屬[3]，本研究中2株大豆根瘤菌分別歸屬于慢生根瘤菌屬(低硒大豆根瘤菌供試菌株)和中華根瘤菌屬(高硒大豆根瘤菌供試菌株)，這與前人研究一致。管風貞[13]利用16S rDNA進行序列分析，確定紫云英根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位分屬于中慢生根瘤菌屬、黃單孢菌屬、土壤桿菌屬、根瘤菌屬等，本研究中4株紫云英根瘤菌分屬于其中的土壤桿菌屬和根瘤菌屬。

圖5 基于鄰接法構(gòu)建的16S rRNA全序列系統(tǒng)分類樹狀圖Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences using neighbour-joining method

A～C：硒濃度為5～7μg/mLA-C: The selenium concentration is 5-7 μg/mL圖6 竹山根瘤菌Fig.6 Zhushan rhizobium

A～C：硒濃度為5～7μg/mLA-C: The selenium concentration is 5-7μg/mL圖7 煉鐵灣根瘤菌Fig.7 Liantiewan rhizobium

A～C：硒濃度為5～7μg/mLA-C: The selenium concentration is 5-7μg/mL圖8 漁塘壩根瘤菌Fig.8 Yutangba rhizobium

盡管分離得到的根瘤菌歸屬到了已有的屬別，但本文從它們的耐硒能力方面著手，得到了不同根瘤菌有不同耐硒能力的實驗結(jié)果。從各菌株的耐硒能力來看，高硒自然環(huán)境下生長的根瘤菌有較強耐硒能力。同時，紫云英根瘤菌的耐硒能力高于大豆根瘤菌。因為大豆和紫云英根瘤菌分屬不同的屬別，這也間接說明不同屬別的根瘤菌具有不同的耐硒能力。這些結(jié)果豐富了根瘤菌生理特性研究，從而拓寬根瘤菌的應(yīng)用范疇。據(jù)文獻報道[14]，接種根瘤菌能促進超聚硒植物黃芪對硒的吸收；Pilon-Smits等[15]研究了土壤生態(tài)環(huán)境與雙溝黃芪超聚集硒之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)超聚硒植物與生態(tài)伙伴對硒的抗性有關(guān)，生態(tài)伙伴其中就包括共生細菌。本文篩選出來的部分耐硒根瘤菌，與宿主植物共生后，是否具有更強的促進植物硒吸收的能力，或者是否能提高植物對髙硒環(huán)境的抗性，也需要進行進一步的研究。

A～C：硒濃度為4～6 μg/mLA-C: The selenium concentration is 4-6 μg/mL圖9 曾家根瘤菌Fig.9 Zengjia rhizobium

A～C：硒濃度為2～4 μg/mLA-C: The selenium concentration is 2-4 μg/mL圖10 低硒根瘤菌Fig.10 Dixi rhizobium

A～C：硒濃度為2～4 μg/mLA-C: The selenium concentration is 2-4 μg/mL圖11 高硒根瘤菌Fig.11 Gaoxi rhizobium

4 結(jié) 論

本研究分離得到6個根瘤菌菌株，分屬4個不同的屬別，分別為土壤桿菌屬(Agrobacterium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、和根瘤菌屬(Rhizobium)。在高硒自然環(huán)境(竹山、煉鐵灣、漁塘壩、曾家)下生長的根瘤菌有較強耐硒能力，紫云英根瘤菌的耐硒能力高于大豆根瘤菌。