薛南南，房 康，張玥輝，陳 萌，王 輝，張欣鈺，吳高榮，郭文博，賈曉慧，王鵬龍，雷海民

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

核桃（Juglans L．），又名羌果[1]、胡桃[2]，為胡桃科植物胡桃Juglans regia L．的干燥成熟果實，可供藥食兩用，《本草綱目》記載，核桃善補(bǔ)氣養(yǎng)血、潤燥痰、益命門[3]，且為中國第二大油料作物[4]。核桃仁中富含油脂及優(yōu)質(zhì)蛋白，此外，還含有糖類、維生素、鈣、鉀、錳、卵磷脂、褪黑素、氨基酸及不飽和脂肪酸等[5]。核桃蛋白主要由谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白組成，含有18種氨基酸，其中8種人體必需氨基酸，其中，谷氨酸、天門冬氨酸和精氨酸含量較高[6-7]，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源。

由于核桃中富含的不飽和脂肪酸具有防治心腦血管疾病、降血脂、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化等作用[8]，使得市場上對核桃油的需求越來越大，而核桃榨油的副產(chǎn)物——核桃粕的產(chǎn)品附加值低，造成了極大的資源浪費，且核桃粕中蛋白含量達(dá)30%以上[9]。文獻(xiàn)報道稱核桃蛋白及其水解物具有抗癌（乳腺癌、結(jié)腸癌）[10-12]、抗氧化[13]、神經(jīng)保護(hù)[14]、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶[15]等作用，因此，對核桃粕進(jìn)行深入的開發(fā)利用具有十分重要的意義。

近年來，已有文獻(xiàn)報道核桃粕蛋白的提取工藝[16-17]，采取的方法主要有超聲波輔助法[18]、膜分離法、離子交換法及反膠束法[19]等，其方法各異、操作步驟簡繁不一及產(chǎn)品性狀差異，且多需借助專屬性較強(qiáng)的分離材料等，使得核桃粕蛋白的工業(yè)化提取很難實現(xiàn)，仍停留在實驗室階段，造成了無法對核桃粕進(jìn)行更進(jìn)一步的精深加工及資源的持續(xù)浪費。如何更加簡單、高效、低能耗的綜合利用核桃粕蛋白，是核桃行業(yè)面臨的主要現(xiàn)實難題。故本研究旨在探索在簡單機(jī)械攪拌條件下，結(jié)合單因素及響應(yīng)面實驗優(yōu)化堿溶酸沉法制備核桃粕蛋白過程中NaOH濃度、液料比、提取時間及溫度等參數(shù)，優(yōu)化出核桃粕蛋白提取的最佳工藝，并初步探討了木瓜蛋白酶解核桃蛋白產(chǎn)物的體外抗氧化能力，為核桃粕的開發(fā)利用及后續(xù)研究提供參考價值，使核桃粕“變廢為寶”提高其經(jīng)濟(jì)價值。

1 實驗儀器與試劑

1.1 儀器 離心機(jī)（上海壘固儀器有限公司飛鴿牌 TDL-5-A）；凍干機(jī)（德國Christ Beta 2-8 LDplus）；紫外分光光度儀（HitachiUH5300Spectrophotometer）、電熱恒溫水浴箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司DK-600）、電子分析天平（德國賽多利斯公司）、恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9075A型）、高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific Lengend MICRO 21R）。

1.2 試劑 氫氧化鈉（NaOH）、濃鹽酸（HCl）、五水硫酸銅、酒石酸鈉鉀（分析純，北京化工廠），牛血清白蛋白（阿拉丁公司），500 000 U/g木瓜蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司），其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 單因素實驗 分別考察NaOH濃度、液料比、提取時間及溫度對核桃蛋白提取率的影響，實驗方法：核桃粕粉末加入NaOH溶液，靜置浸泡，加熱攪拌提取，室溫冷卻3 000 r/min離心20 min，上清液用1．0 mol/L HCl調(diào)至 pH 4．5，3 000 r/min 離心 20 min，沉淀用去離子水反復(fù)洗滌3次（至中性），冷凍干燥，即得核桃蛋白粉末（實驗設(shè)計及方案，見表1）。

表1 單因素實驗設(shè)計方案Tab.1 Single factor experimental design

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化核桃粕蛋白提取工藝 結(jié)合單因素實驗結(jié)果，選取NaOH濃度、液料比及提取溫度，運用 Design Expert 8．0．5 軟件，設(shè)計 3 因素 3 水平的響應(yīng)面實驗（見表2），以核桃蛋白提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化核桃粕蛋白提取工藝。

表2 因素與水平編碼表Tab.2 Coding of factors and levels

2.3 木瓜蛋白酶解物的制備 將制得的核桃蛋白配制成4．0%的蛋白溶液，0．5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至 8．0，保持 55 ℃恒溫，加入 2．0%500 000 U/g木瓜蛋白酶，水解6 h后100℃加熱15 min使酶滅活，1．0 mol/L HCl調(diào) pH 至 4．5，4 ℃下 5 000 r/min 離心10 min，上清液冷凍干燥即得木瓜蛋白酶核桃蛋白產(chǎn)物。

2.4 活性評價 參考文獻(xiàn)[20]方法，分別評價木瓜蛋白酶解物的清除DPPH、OH自由基及還原能力（谷胱甘肽為陽性對照）。

2.5 蛋白含量測定 采用雙縮脲法測定蛋白的含量[21]，核桃蛋白提取率（%）=核桃蛋白粉末中蛋白含量/核桃粕質(zhì)量×100%。

3 結(jié)果

3.1 單因素對核桃蛋白提取率的影響

3.1.1 NaOH濃度對蛋白提取率的影響 由圖1可知，NaOH濃度為0．04%時蛋白提取率最高，達(dá)到24．94%，濃度為 0．06%和 0．08% 時次之，0．01% 最低。但提取時NaOH濃度越高，蛋白提取液顏色加深影響產(chǎn)品性狀，故選取 0．02%、0．04%、0．06%作為響應(yīng)面實驗中NaOH濃度的3個水平。

圖1 NaOH濃度對蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of NaOH concentration on protein extraction rates

3.1.2 液料比對蛋白提取率的影響 由圖2可知，液料比在80∶1時，蛋白提取率最高為30．24%，與60∶1 時幾乎相等，而 40∶1、20∶1 次之，10∶1 最低。故選取 40∶1、60∶1、80∶1 作為響應(yīng)面實驗中液料比的3個水平。

圖2 液料比對蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of liquid-to-material ratio on protein extraction rates

3.1.3 提取時間對蛋白提取率的影響 由圖3可知，提取時間對蛋白提取率的影響隨時間的升高而增大，60 min時，蛋白提取率較高，但是在80 min和120 min時，并無較大提升，曲線較坡。所以從節(jié)省時間及縮短提取提取周期的角度上，選擇60 min作為響應(yīng)面實驗中核桃蛋白的提取時間。

圖3 提取時間對蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on protein extraction rates

3.1.4 提取溫度對蛋白提取率的影響 由圖4可知，溫度為60℃時蛋白提取率最高為18．40%，50℃、70℃次之，因為核桃蛋白的變性溫度為67．01℃[9]，故選取45℃、55℃、65℃作為響應(yīng)面實驗中溫度的3個水平。

圖4 提取溫度對蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on protein extraction rates

3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取 NaOH 濃度（X1）、液料比（X2）及提取溫度（X3）3因素，以核桃蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實驗。設(shè)計及結(jié)果見表3。

3.2.2 實驗結(jié)果回歸方程方差分析 采用Design Expert 8．0．5軟件對響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合，得二次多項式回歸方程：Y=32．61+1．18X1+1．96X2+2．24X3-0．65X1X2-1．26X1X3-（R2=0．932 2 Adj R2=0．845 1）。回歸分析結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Box-Behnken experimental design and results

表4 回歸分析結(jié)果Tab.4 Results of regression analysis

由表 3可知，該模型的 P＜0．01，表明回歸模型極顯著，并且失擬項 P=0．633 3＞0．05，表明該響應(yīng)面實驗的結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，實驗的誤差小。因此，可以使用該數(shù)學(xué)模型對響應(yīng)面法提取核桃蛋白的實驗結(jié)果進(jìn)行分析。F 檢驗發(fā)現(xiàn)，X1、X2、X3、與響應(yīng)值（Y）顯著相關(guān)。各因素對蛋白提取率的影響由大到小依次是X3＞X2＞X1，其中X3和X2的影響極顯著（P＜0．01），X1顯著（P＜0．05）；二次項中 X1對核桃蛋白提取率的影響顯著（P＜0．05）；交互項中，只有X1X3對蛋白提取率的影響有顯著作用（P＜0．05），而 X1X2、X2X3之間的交互作用不顯著。

3.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 為了更加直觀地反映三因素間的相互作用，采用Design-Expert 8．0．5軟件繪制響應(yīng)面及等高線圖，并進(jìn)行分析（分別見圖5、6和7）。由圖5可見，響應(yīng)面較坡，說明NaOH濃度和液料比之間的交互作用不明顯，NaOH濃度一定時，隨著料液比的增大，蛋白提取率基本呈升高趨勢；當(dāng)液料比一定時，隨著NaOH濃度的增大，蛋白提取率也呈現(xiàn)相同的趨勢。由圖6可見，響應(yīng)面坡度較陡，等高線成橢圓形，說明NaOH濃度和提取溫度之間的交互作用顯著，NaOH濃度一定時，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率呈升高趨勢，可能是在不超過核桃蛋白的變性溫度下，蛋白提取率隨著溫度的升高，蛋白溶解的越多，而NaOH濃度一定時，隨著液料比的增大，蛋白提取率先增加后降低。由圖7可知，響應(yīng)面較坡，說明提取溫度和液料比之間交互作用不明顯，提取溫度一定時，隨著液料比的增大，蛋白提取率呈升高趨勢，而當(dāng)液料比一定時，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率也呈相同趨勢。

圖5 NaOH濃度和液料比對蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of NaOH concentration and liquid-to-material ratio on protein extraction rates

圖6 NaOH濃度和提取溫度對蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of NaOH concentration and extraction temperature on protein extraction rates

圖7 提取溫度和液料比對蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and liquid-to-material ratio on protein extraction rates

綜上所述，NaOH濃度與提取溫度之間的交互作用對蛋白提取率影響顯著，運用Design-Expert 8．0．5軟件對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的最佳提取工藝條件為：0．04%NaOH 溶液、80∶1 液料比、溫度為65℃、提取1 h，預(yù)測蛋白提取率為35．27%。

3.2.4 響應(yīng)面結(jié)果的驗證 為驗證模型預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝條件進(jìn)行核桃粕蛋白提取，3次平行實驗，所得蛋白提取率的平均值為36．01%，與預(yù)測值35．27%較為接近。

3.3 抗氧化活性結(jié)果 由圖8可知，在濃度分別為0．05、0．10、0．15、0．20 及 0．25 mg/mL 下，木瓜蛋白酶解物對DPPH自由基的清除率幾乎與谷胱甘肽相等，且清除能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)，在0．25 mg/mL濃度下清除率達(dá)為96．09%，而谷胱甘肽為97．60%，說明木瓜蛋白酶核桃蛋白酶解物具有較好的清除DPPH自由基的能力。由圖9可知，核桃蛋白酶解物對OH自由基的清除作用弱于谷胱甘肽，且基本為谷胱甘肽的50%，最大濃度10．0 mg/mL時，木瓜蛋白酶的OH自由基清除率為33．39%，為谷胱甘肽（67．71%）的50%。說明核桃蛋白酶解物的OH自由基清除能力較弱。由圖10可知，陽性對照谷胱甘肽具有較強(qiáng)的還原力，且呈劑量依賴性關(guān)系，而核桃蛋白酶解物的還原能力遠(yuǎn)不及谷胱甘肽，且無明顯的量效關(guān)系。

綜上所述，核桃蛋白酶解物具有體外抗氧化活性，具備較強(qiáng)的開發(fā)利用價值，可為后續(xù)核桃粕的產(chǎn)品研發(fā)及研究等提供參考意義。

圖8 核桃蛋白酶解物DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rate of walnut protein hydrolysate

圖9 核桃蛋白酶解物OH自由基清除率Fig.9 OH free radical scavenging rate of walnut protein hydrolysate

圖10 核桃蛋白酶解物還原能力Fig.10 Reducing ability of walnut protein hydrolysate

4 討論

目前，對核桃粕的開發(fā)及利用研究還不夠深入，大部分核桃粕仍被丟棄，附加值較低，如何利用廢棄的、資源利用度低的核桃粕開發(fā)出具有保健作用的食品及保健品等成為一項很重要的課題。本實驗通過單因素及響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化得到的核桃粕蛋白提取工藝，具有快速、成本低、操作簡便及產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，且通過綠色、無污染的酶解法制備的核桃蛋白酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，這些可為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、為后續(xù)的核桃粕保健食品、藥品研發(fā)及提高核桃資源的利用度等提供重要的參考依據(jù)，進(jìn)而實現(xiàn)對核桃粕的精深加工及產(chǎn)品開發(fā)，打破中國核桃蛋白行業(yè)一直以來的瓶頸狀態(tài)。