黃 平， 吳世旺， 江正強， 楊紹青

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083)

纖維素是由β-D-葡萄糖殘基通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的直鏈多糖，一般含有3 000～10 000個葡萄糖殘基。通常將能水解裂纖維素的β-1,4-糖苷鍵的酶稱為纖維素酶。纖維素酶按其催化作用特點分為三類：內(nèi)切-1,4-β-D-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切-β-1,4-D-葡聚糖酶(EC 3.4.1.91)、β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。內(nèi)切-β-1,4-D-葡聚糖酶也稱為內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶，在纖維素的內(nèi)部無定形位點隨機切割β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生各種長度的低聚糖；外切-β-1,4-葡聚糖酶也稱外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶、1,4-β-纖維二糖水解酶，水解纖維素或纖維四糖的β-1,4-糖苷鍵，從非還原性末端依次切下纖維二糖分子；β-葡萄糖苷酶也稱龍膽二糖酶、纖維二糖酶、苦杏仁酶，可以將纖維二糖等纖維寡糖末端非還原端的β-D-葡萄糖殘基水解，釋放β-D-葡萄糖[1]。若將纖維素降解成最終產(chǎn)物β-D-葡萄糖，至少需要3種纖維素酶的共同作用。內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，通過外切葡聚糖酶將其水解成纖維二糖和三糖，最后通過β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成β-D-葡萄糖。纖維二糖是內(nèi)切酶和外切酶的抑制劑，通過加入β-葡萄糖苷酶可以有效降低抑制作用，提高纖維素降解率。

本研究克隆了巴倫葛茲類芽孢桿菌(Paenibacillusbarengoltzii) CAU904 GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因并在大腸桿菌中表達(dá)，研究了重組β-葡萄糖苷酶(PbBglu3)的酶學(xué)性質(zhì)，進一步解析了其晶體結(jié)構(gòu)，初步闡明了其催化機制，希望為后續(xù)該酶的理性設(shè)計提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

ExTaq DNA Polymerase、PrimeSTAR HS DNA polymerase、限制性內(nèi)切酶、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、DNA Marker、PrimeScript Reverse Transcriptase(RNase H-)，購自TaKaRa公司；T4 DNA ligase，購自NEB公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒，購自北京博邁德公司；高純質(zhì)粒小量制備試劑盒，購自北京天根生化公司；Ni-IDA agarose，購自GE公司；薄層層析Gel Plate F254，購自Merck公司；大麥β-葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖、樺木木聚糖、微晶纖維素、CMC、pNP-β-Xylopyranoside、pNP-α-Galactopyranoside、pNP-β-Galactopyranoside、pNP-β-Glucopyranoside、 pNP-α- Glucopyranoside，購自Sigma公司；纖維寡糖、昆布寡糖，購自Megazyme公司；結(jié)晶篩選試劑盒，購自Hampton公司。

巴倫葛茲類芽孢桿菌CAU904為本實驗室篩選保藏；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21(DE3)，購自北京博邁德公司；pET-28a(+)，購自Novagen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1菌株培養(yǎng)和基因組DNA的提取

斜面培養(yǎng)基上活化的單菌落接入液體培養(yǎng)基，45 ℃搖瓶培養(yǎng)3 d，離心收集適量菌體(12 000 r/min，3 min)?；蚪MDNA 的提取采用CTAB法。

1.2.2β-葡萄糖苷酶基因克隆

根據(jù)巴倫葛茲類芽孢桿菌基因組(NZ_KE159654.1)中β-葡萄糖苷酶基因序列和表達(dá)載體pET-28a(+)的多克隆位點，設(shè)計正向引物BgluF：5’-TGACTGCTAGCATGAGCAAATCGATGTTAGGTG TT-3’(下劃線處為NheⅠ酶切位點)；反向引物BgluR：5’-TGACTCTCGAGTTAAA TAAACTCGATCCACTCAATCTCC-3’ (下劃線處為XhoⅠ酶切位點)。以基因組DNA為模板，PCR條件為94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s ；72 ℃ 3 min，34個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產(chǎn)物。將目的片段連接至pMD-19T載體，熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選陽性菌落，提取T/A克隆質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后，測序驗證。將測序正確的重組質(zhì)粒用NheⅠ和XhoⅠ酶切后，回收目的片段，連接至pET-28a(+)載體，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，在含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3PbBglu3的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

挑取陽性轉(zhuǎn)化子于10 mL LB(含50 μg/mL卡那霉素)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接到300 mL相同培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h后，離心收集菌體。菌體用20 mL的緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)懸浮，超聲破碎(200 W，破碎3 s，間歇4 s，破碎90次)3個循環(huán)。將破碎后的菌體離心(10 000 r/min，10 min)，收集上清液，即粗酶液。

PbBglu3采用Ni-IDA親和層析進行純化，將粗酶液以0.5 mL/min流速上樣于經(jīng)過緩沖液A預(yù)平衡的Ni-IDA層析柱。用緩沖液A以1 mL/min洗滌柱子至流穿液OD280小于0.05時，用緩沖液B液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH值8.0)進行洗脫，SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)純度。

1.2.4酶活力和蛋白濃度測定

酶活力測定：75 μL 15 mmol/L底物pNPG(蒸餾水配制)，加150 μL MOPS(morpholino propanesulfonic acid)(pH值6.5～8.0)緩沖液(50 mmol/L，pH值7.5)，50 ℃預(yù)熱4 min后，加入25 μL適當(dāng)稀釋的酶液，50 ℃反應(yīng)10 min，加750 μL的飽和硼酸鈉溶液終止反應(yīng)，冷卻后測定OD405。

1個酶活力單位(U)定義：在實驗條件下，每分鐘生成的1 μmol pNP所需要的酶量。

蛋白含量的測定采用Lowry法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5PbBglu3的最適pH值和pH值穩(wěn)定性測定

最適pH值測定：50 ℃條件下，在pH值4.0～10.5的不同緩沖體系中測定酶活力。緩沖體系分別為Citrate(pH值4.0～6.0)、Acetate(pH值4.0～4.5)、Bis-Tris(bis-(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl) methane)(pH值5.5～7.5)、MOPS、HEPES(z-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)(pH值6.5～8.5)、Tris-HCl(pH值7.0～9.0)、CHES(N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid)(pH值8～10.5)，以酶活力最高點為100%。pH值穩(wěn)定性測定是用不同緩沖體系將純酶稀釋適當(dāng)倍數(shù)，50 ℃保溫30 min，冰水浴中冷卻30 min后， 按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液為對照，計算殘余酶活力占對照酶活力的百分比。

1.2.6PbBglu3的最適溫度及溫度穩(wěn)定性測定

最適溫度的測定是以50 mmol/L，pH值7.5 MOPS緩沖液將PbBglu3稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，分別在不同溫度下(30～80 ℃)測定酶活力，以酶活力最高點為100%。溫度穩(wěn)定性的測定是用同樣的緩沖液將PbBglu3稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，分別置于不同溫度下處理30 min，冰水浴冷卻30 min后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液為對照，計算殘余酶活力占對照酶活力的百分比。

1.2.7PbBglu3底物特異性測定

PbBglu3的底物特異性測定是以pNP-糖苷(pNP-α-D-galactoopyranoside、pNP-β-D-galactoopyranoside、 pNP-α-D-glucopyranoside、pNP-β-D-glucopyranoside、pNP-β-D-xylopyranoside)、低聚糖及糖苷類化合物(纖維寡糖、昆布寡糖、龍膽二糖、槐糖、乳糖、苦杏仁苷和水楊苷)和聚糖(樺木木聚糖、昆布多糖、地衣多糖、大麥葡聚糖、幾丁質(zhì)、羧甲基纖維素鈉和結(jié)晶纖維素)為反應(yīng)底物測定酶活力。酶活力測定方法為225 μL 5 mmol/L pNP-糖苷類底物，或10 mg/mL低聚糖及糖苷類化合物底物，或10 mg/mL聚糖類底物(均用50 mmol/L，pH值7.5 MOPS緩沖液配制)，50 ℃預(yù)熱4 min后，加入25 μL適當(dāng)稀釋的酶液，50 ℃反應(yīng)10 min，加750 μL的飽和硼酸鈉溶液終止反應(yīng)，冷卻后分別測定OD410、葡萄糖(使用葡萄糖氧化酶試劑盒測定)和還原糖(采用DNS法)。對于纖維二糖、龍膽二糖、昆布二糖和槐糖等二糖，1個酶活力單位(U)為，在測定條件下每分鐘生成的2 μmol葡萄糖所需的酶量。

1.2.8PbBglu3的水解特性測定

采用TLC(薄層層析法)對PbBglu3水解纖維寡糖、昆布寡糖和昆布多糖生成的水解產(chǎn)物進行分析。在10 mg/mL水解底物 (用50 mmol/L，pH值7.5 MOPS緩沖液配制)中加入5 U/mL的PbBglu3，50 ℃反應(yīng)2 h，定時取樣，沸水浴煮沸5 min，終止反應(yīng)。冷卻后離心取上清液分析水解情況，展層劑為正丁醇∶水∶乙酸，三者體積比為2∶1∶1；顯色劑為甲醇∶硫酸，體積比為95∶5。

1.2.9PbBglu3的晶體篩選及結(jié)構(gòu)解析

PbBglu3結(jié)晶初篩質(zhì)量濃度為18 mg/mL，緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH值8.0。結(jié)晶試劑盒為Hampton Research公司的Crystal ScreenTM、IndexTM、PEG/IonTM和SaltRxTM以及北京博亞結(jié)晶公司的BCR。采用坐滴氣相擴散法進行結(jié)晶條件篩選和優(yōu)化。

于上海同步輻射光源生物大分子線站收集X-射線衍射數(shù)據(jù)，使用HKL2000軟件對數(shù)據(jù)進行前期處理。以Thermotoganeapolitana來源的GH3家族β-葡萄糖苷酶TnBgl3B(PDB：2X40)為模板[2]，利用Phenix軟件包進行分子置換[3]，得到PbBglu3初始結(jié)構(gòu)。經(jīng)Phenix.autobuilding重建，多輪COOT[4]手工調(diào)整與Phenix.Refine精修完善后獲得最終的結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆和表達(dá)結(jié)果分析

利用引物BgluF和BgluR，擴增得到一條2 799 bp的片段。該基因編碼932個氨基酸，預(yù)測無信號肽序列及理論分子量和等電點分別為102.2 kDa和5.02。經(jīng)NCBI BLAST比對分析，該酶的氨基酸序列與來源于坎氏弧菌(Vibriocampbellii)的GH3家族β-葡萄糖苷酶(AJK27091.1)相似性最高，為59%。結(jié)構(gòu)域分析顯示，該PbBglu3含有GH3家族的特征結(jié)構(gòu)域、一個FnⅢ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域和一個CBM6結(jié)構(gòu)域。

將該基因插入到pET-28a(+)載體NheⅠ和XhoⅠ酶切位點之間，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28-PbBglu3。重組載體轉(zhuǎn)化入E.coilBL21(DE3)進行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測能夠可溶性表達(dá)。

2.2 PbBglu3的純化結(jié)果分析

粗酶液經(jīng)親和層析得到電泳級純酶，PbBglu3純化結(jié)果見表1。由表1可知，PbBglu3純化了15.9倍，回收率為57%，比酶活力為119.6 U/mg。該酶的比酶活力高于來源于AspergillusochraceusMTCC 1810[5](4.60 U/mg)、Aspergillusterreus[6](42.37 U/mg)、AspergillusfumigatusZ5[7](101.7 U/mg)和Myceliophthorathermophila[8](97.7 U/mg)的β-葡萄糖苷酶的比酶活力，但低于來源于ThermotoganaphthophilaRUK-10[9](2 851.7 U/mg)、TalaromycesleycettanusJCM 12802[10](905 U/mg)、PenicilliumpurpurogenumKJS506[11](857 U/mg)和Neurosporacrassa[12](143.27 U/mg)的β-葡萄糖苷酶的比酶活力。

表1 PbBglu3純化結(jié)果

2.3 pH值對PbBglu3酶活力和穩(wěn)定性的影響

pH值對PbBglu3的酶活力和穩(wěn)定性影響結(jié)果見圖1。圖1(a)中，PbBglu3的最適pH值為7.5，在pH值4.5～9.0范圍內(nèi)處理30 min，可以保持80%以上的酶活力(圖1(b))，表現(xiàn)出良好的pH值穩(wěn)定性。大多β-葡萄糖苷酶的最適pH值偏酸性，而本研究中β-葡萄糖苷酶與Paenibacillussp. C7[13]和Bacillussp.[14]的β-葡萄糖苷酶特性相似，具有偏堿性的最適pH值。這一特性使其在洗滌劑、化妝品和釀酒等行業(yè)中具有潛在應(yīng)用價值。

檸檬酸緩沖液(●)，乙酸緩沖液(×)，Bis-Tris緩沖液(◆)，MOPS緩沖液(▲)，Tris-HCl 緩沖液(□)，HEPES緩沖液(■)，CHES緩沖液(△)。圖1 pH值與PbBglu3的酶活力及穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.1 Effect of pH on activity and stability of PbBglu3

2.4 溫度對PbBglu3酶活力和穩(wěn)定性的影響

溫度對PbBglu3酶活力和穩(wěn)定性影響結(jié)果見圖2。圖2(a)中，PbBglu3的最適溫度為50 ℃。在溫度不高于50 ℃條件下均很穩(wěn)定，殘余酶活在95%以上，當(dāng)溫度高于50 ℃時酶活力迅速下降(圖2(b))。大多β-葡萄糖苷酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性普遍在40～100 ℃。該酶的最適溫度與來源于MucorcircinelloidesNBRC 4572的β-葡萄糖苷酶(50 ℃)一致[15]，但是顯著低于Thermofilumpendensβ-葡萄糖苷酶(90 ℃)[16]。PbBglu3的最適溫度處于中等水平，溫度穩(wěn)定性并不突出。

2.5 PbBglu3的底物特異性分析

PbBglu3底物特異性分析結(jié)果見表2。表2表明，對于pNP糖苷類底物，PbBglu3對pNP-β-D-glucopyranoside表現(xiàn)出很高的活性，同時對pNP-β-D-xylopyranoside有較弱的水解活性，但對pNP-α-D-glucopyranoside、pNP-α-D-galactopyranoside和pNP-β-D-galactopyranoside沒有水解活性。對于低聚糖及糖苷類化合物底物，該酶對纖維二糖(β-1,4-糖苷鍵連接)、纖維三糖(β-1,4-糖苷鍵連接)、纖維四糖(β-1,4-糖苷鍵連接)、昆布二糖(β-1,3-糖苷鍵連接)、昆布三糖(β-1,3-糖苷鍵連接)、龍膽二糖(β-1,6-糖苷鍵連接)、槐糖(β-1,2-糖苷鍵連接)、苦杏仁苷(β-1,6-糖苷鍵連接)和水楊苷(β-1,4-糖苷鍵連接)均具有活性，但沒有乳糖水解活性。對于聚糖類底物，該酶對昆布多糖、大麥葡聚糖和地衣多糖均具有一定的水解活性，對木聚糖、幾丁質(zhì)、羧甲基纖維素鈉和結(jié)晶纖維素沒有水解活性。大麥葡聚糖是由纖維三糖或纖維四糖通過β-1,3-糖苷鍵連接成的分支多糖，地衣多糖是由纖維三糖分子以β-1,3-糖苷鍵連接成的直鏈多糖，而昆布多糖則是通過β-1,3和β-1,6-糖苷鍵連接形成的分支多糖。由此可知，PbBglu3能夠作用于β-1,2、β-1,3、β-1,4和β-1,6等多種糖苷鍵，因此PbBglu3屬于第三類底物特異性較寬的β-葡萄糖苷酶。

圖2 溫度與PbBglu3的酶活力及穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.2 Effect of temperature on activity and stability of PbBglu3

底物比酶活力/(U·mg-1)相對酶活力/%糖苷類化合物pNP-β-D-glucopyranoside119.6100pNP-α-D-glucopyranosideNDNDpNP-β-D-galactopyranosideNDNDpNP-α-D-galactopyranosideNDNDpNP-β-D-xylopyranoside2.31.9糖苷和低聚糖Cellobiose(纖維二糖)8.87.6Cellotriose(纖維三糖)9.07.7Cellotetraose(纖維四糖)21.918.9Laminaribiose(昆布二糖)3.93.3Laminaritriose(昆布三糖)16.213.9Gentiobiose(龍膽二糖)10.510.5Sophorose(槐糖)4.64.0Amygdalin(苦杏仁苷)7.46.2Salicin(水楊苷)6.85.7Lactose(乳糖)NDND聚糖Laminarin(昆布多糖)8.06.9Barley glucan(大麥葡聚糖)4.74.0Lechnin(地衣多糖)4.84.0Xylan(木聚糖)NDNDChitin(幾丁質(zhì))NDNDCarboxymethylcellulose sodium(羧甲基纖維素鈉)NDNDAvicel(結(jié)晶纖維素)NDND

2.6 PbBglu3的水解特性分析

PbBglu3水解特性分析結(jié)果見圖3。圖3表明，PbBglu3對纖維寡糖(聚合度2- 4)、昆布寡糖(聚合度2- 4)、地衣多糖、大麥葡聚糖和昆布多糖的最終產(chǎn)物都是葡萄糖。PbBglu3水解多糖的過程中只有單糖生成，說明其具有外切β-1,3-葡聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性。

M：標(biāo)準(zhǔn)；G：葡萄糖；G2：纖維二糖；G3：纖維三糖；G4：纖維四糖；L2：昆布二糖；L3：昆布三糖；L4：昆布四糖。圖3 PbBglu3水解產(chǎn)物分析Fig.3 TLC analysis of hydrolysis products by PbBglu3

2.7 PbBglu3的晶體結(jié)構(gòu)分析

圖4 PbBglu3的總體結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域分析及其比較Fig.4 Analysis of overal structure and structure domain of PbBglu3, and structure comparison with other β-glucosidase

PbBglu3晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果見圖4。PbBglu3晶體空間群為P212121，衍射數(shù)據(jù)最終分辨率為1.73 ?。 PbBglu3的總體結(jié)構(gòu)如圖4(a)。圖4(a)中，每個不對稱單元(ASU)中含有一個蛋白分子，呈現(xiàn)GH3家族典型的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，類似 (α/β)5的三明治結(jié)構(gòu)域、FnⅢ結(jié)構(gòu)域、(β/α)8折疊桶結(jié)構(gòu)域和CBM6結(jié)構(gòu)域。該酶的結(jié)合位點位于折疊桶結(jié)構(gòu)域和三明治結(jié)構(gòu)域的中間，其催化氨基酸E168和D747分別位于這兩個結(jié)構(gòu)域。該酶形成一個催化口袋(圖4(b))，能夠特異性地結(jié)合糖鏈的非還原端。與GH3家族的另一個結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析的β-葡萄糖苷酶TnBgl3B[2]不同的是，該酶的(β/α)8折疊桶結(jié)構(gòu)域被移到了C端，緊接著CBM6結(jié)構(gòu)域(圖4(c))。該CBM6結(jié)構(gòu)域的存在對底物的結(jié)合具有一定的影響，它們的空間相對位置依然保守，只是形成了一段較大的linker，由兩個反向平行的β-折疊卷構(gòu)成(圖4(d))。相對于其他β-葡萄糖苷酶較短的linker，該酶在此對應(yīng)區(qū)域具有較大的柔性，有利于酶催化過程中(α/β)5的三明治結(jié)構(gòu)域和FnⅢ結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生移動，使酶能夠與底物更好結(jié)合在一起。分析發(fā)現(xiàn)，芳香氨基酸殘基Trp748側(cè)鏈提供-1位結(jié)合位點，Trp749提供+1位結(jié)合位點，Trp131提供+2位結(jié)合位點，這些位點的存在形成了一個小的口袋和疏水環(huán)境，不利于轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)的進行，這在結(jié)構(gòu)上也解釋了PbBglu3轉(zhuǎn)糖苷作用弱的原因。

3 結(jié) 論

從巴倫葛茲類芽孢桿菌CAU904中克隆表達(dá)得到一個GH3家族β-葡萄糖苷酶(PbBglu3)，該酶與來源于VibriocampbelliiGH3家族β-葡萄糖苷酶的同源性最高，為59%。PbBglu3的最適pH值為7.5，最適溫度為50 ℃。該酶具有較寬的底物特異性范圍，能夠水解β-1,2、β-1,3、β-1,4、β-1,6-糖苷鍵等多種類型糖苷鍵。PbBglu3還能夠水解昆布多糖、大麥β-葡聚糖和地衣多糖，產(chǎn)物均為β-D-葡萄糖。通過X-射線晶體衍射法解析了PbBglu3的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)信息顯示其含有4個結(jié)構(gòu)域，同時解釋了該酶轉(zhuǎn)糖苷作用弱的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。