董俏言 石 慧綜述 李建遠，2?審校

1.煙臺大學生命科學學院(264000)；2.國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所，國家衛(wèi)生健康委男性生殖健康重點實驗室

精子凍存技術(shù)對于輔助生育、生育力保存和科學研究具有重要意義。我國的高不育率及輔助生殖技術(shù)的低成功率，均提示需要提高精子的凍存技術(shù)，為臨床提供更高質(zhì)量的精子。本文對精子冷凍損傷和冷凍保護的相關研究綜述如下。

1 冷凍損傷

冷凍復蘇可以導致冰晶形成、氧化－還原反應失衡，以及生物大分子改變。

1.1 冰晶形成

精子細胞膜具有較高的流動性，水含量較低，僅有50%，使得精子對冷凍損傷不敏感。但是在冷凍過程中，溫度的巨大變化、滲透壓的改變以及細胞內(nèi)冰晶的形成均會導致其結(jié)構(gòu)和功能的損傷[1-2]。在冷凍過程中，冷凍速率決定精子凍傷的程度。過快降溫導致胞內(nèi)水分流出細胞膜受阻，產(chǎn)生胞內(nèi)冰晶，破壞細胞膜，影響細胞器功能，進而導致細胞死亡；過慢的降溫使胞內(nèi)的水分通過細胞膜流出，細胞質(zhì)濃縮，胞內(nèi)滲透壓增加，細胞脫水[3]，也會因為胞內(nèi)鹽濃度增加，造成鹽害。過快或過慢降溫均能造成細胞冷凍損傷。

1.2 氧化－還原反應失衡

正常的精子存在抗氧化防御系統(tǒng)，如精子中的抗氧化蛋白家族，精漿中過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶，以及非酶抗氧化劑。氧化應激是由細胞中活性氧(ROS)和抗氧化劑防御的失衡引起的，導致細胞成分損害，使必需的代謝酶失活，并破壞信號傳導途徑。在冷凍過程中，精漿中的抗氧化物質(zhì)被稀釋，精子中的氧化防御能力被削弱，平衡被打破，精子中ROS積聚會對細胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)以及膜脂質(zhì)造成損傷，并且會誘導細胞色素C和來自線粒體的凋亡因子的釋放，最終導致細胞凋亡[4]。

1.3 生物大分子改變

精子經(jīng)過冷凍復蘇后，精子的膜結(jié)構(gòu)受損。同時膜本身的蛋白、磷脂和多糖，以及核酸均會發(fā)生改變。

1.3.1 蛋白質(zhì) 精子蛋白的改變通常是表達量的變化，即表達量增加或降低。目前認為，表達量降低是因為蛋白質(zhì)的降解，或者蛋白質(zhì)在精子中遷移的結(jié)果；表達量增加的機制還不明確。精子在冷凍復蘇過程中蛋白表達活動不活躍，磷酸化、蛋白翻譯后修飾、二級或三級結(jié)構(gòu)變化或蛋白轉(zhuǎn)移可能是精子蛋白表達量增加的原因[5]。

1.3.2 磷脂 冷凍復蘇能夠引起精子膜磷脂的顯著變化，冷凍后精子會失去大量的磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺，增加膽固醇的含量[6]，以及導致各種磷脂脂肪酸的含量發(fā)生變化，內(nèi)側(cè)磷脂層中磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油增加，外層磷脂層中磷脂酰乙醇胺、二磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇增加[7-8]。

1.3.3 多糖 精子表面有一個復雜的糖蛋白復合物，含有大量的O-糖蛋白和N-糖蛋白。在冷凍復蘇過程中，糖蛋白種類發(fā)生改變。其中，人類精子中半乳糖和N-乙酰半乳糖胺的含量明顯降低[9]。

2 冷凍保護

近年來，關于如何提高精子冷凍復蘇效果的報道越來越多。主要通過冷凍復蘇過程中的幾個階段實現(xiàn)，即精子優(yōu)選、冷凍保護劑、凍存方法等。

2.1 精子優(yōu)選

一般情況下，冷凍前精子質(zhì)量越高，復蘇后精子質(zhì)量越好，因此可通過精液常規(guī)參數(shù)分析篩選高質(zhì)量精液樣本進行冷凍保存；精漿成分對精子的冷凍損傷具有一定的保護作用，利用耐凍性好的精漿添加或置換不育患者精漿，可得到較好的復蘇效果[10]。精液的耐凍性與季節(jié)有關，3～9月呈明顯下降趨勢，冬季和春季有利于供精者精液儲存[11]。精子分別在離體60min與30min時冷凍保存，其復蘇率有差異，盡快凍存有助于提高精子的冷凍復蘇率[12]。

2.2 冷凍保護劑

現(xiàn)有的冷凍保護劑根據(jù)其功能分為三大類：抑制冰晶的形成，調(diào)節(jié)氧化－還原反應平衡，保護精子功能。

2.2.1 抑制冰晶的形成 甘油、二甲基亞砜、三羥甲基氨基甲烷、乙二醇等為滲透性保護劑，可以減輕細胞滲透性腫脹，減緩細胞脫水速度；糖類、脂類和蛋白質(zhì)作為膨脹劑，提高冷凍延長劑的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度；高溫處理的牛奶和蛋黃經(jīng)常作為膜修飾劑，增強精子的冷凍穩(wěn)定性[13]。相比葡萄糖、3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖、棉子糖或水蘇糖，海藻糖和蔗糖是更有效的冷凍保護劑[14]。

2.2.2 調(diào)節(jié)氧化－還原反應平衡 冷凍精子過程中產(chǎn)生的大量ROS，可破壞精子中的氧化－還原平衡，同時對生物大分子具有氧化作用。目前，已發(fā)現(xiàn)大量的物質(zhì)能夠緩解ROS損傷。在精子冷凍保護劑中添加抗氧化劑，如抗壞血酸、過氧化氫酶、谷胱甘肽(GSH)、維生素E和乙酰左旋肉堿，可以抑制ROS的活性，從而提高精子冷凍復蘇率、精子活力及精子DNA的完整性，抵抗過量ROS引起的氧化應激損傷[15-18]。Liu等[19]在冷凍保護劑中添加人凝血酶抗凝血酶復合物(TAT)過氧化物酶2融合蛋白，顯著降低了細胞內(nèi)的ROS和丙二醛水平，提高了冷凍復蘇后精子的活力，緩解了DNA損傷，也明顯降低了自發(fā)頂體反應，增加了鈣離子載體誘導的頂體反應。3m M褪黑素通過PI3K/Akt信號途徑調(diào)節(jié)蛋白激酶B(Akt)和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)，進而降低細胞內(nèi)ROS含量，增加精子活力，減少精子凋亡和死亡，在人類精子冷凍復蘇過程中保護精子遠離損傷[20]。另外，Hatef等[21]研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞衍生因子-1α(SDF-1α)通過減少線粒體ROS的生成減緩精子氧化應激損傷，減緩冷凍復蘇過程中的細胞凋亡。此外，植物提取物，如白藜蘆醇、槲皮素、黃芪多糖、染料木素、番茄素、絲膠、迷迭香等具有很強的抗氧化能力，而且毒性低[22-27]。

2.2.3 保護精子功能 冷凍復蘇過程中，精子功能蛋白的改變影響精子功能。綿羊的精漿蛋白(BSP1和BSP5)在精子獲能、精卵相互作用中起著關鍵性作用[28]。將其添加到冷凍保護劑中可以防止精子膜損傷、增加精子活力、降低酪氨酸磷酸化水平，也可以修復冷休克精子膜損傷[29-30]。卵母細胞、子宮內(nèi)膜和濾泡液中的SDF-1α能夠提高精子活力，維持正常線粒體狀態(tài)[31-32]。肝素與輸卵管蛋白聯(lián)合添加應用，可以改善復蘇后精子在體外粘液穿透能力[33]。這也表明，由于冷凍損傷的多方面性質(zhì)，需要幾種蛋白質(zhì)聯(lián)合應用以改善精子的受精能力。

2.3 凍存方法

現(xiàn)有的精子冷凍保存方法主要包括4種，分別是慢速冷凍法、快速冷凍法、玻璃化冷凍法及冷凍干燥法。

2.3.1 慢速冷凍法和快速冷凍法 根據(jù)控溫方式的不同，分為手動控溫法和程序控溫法，無論是手動還是程序操作，均對精子產(chǎn)生物理或化學損傷[34]?？焖倮鋬龇ㄏ鄬β倮鋬龇ú僮骱唵?，但是存在很多缺陷，如無法有效的控制冷凍曲線，液氮液面上15～20cm處的溫度不穩(wěn)定(-70℃、-80℃或-99℃)[35]；嘗試調(diào)節(jié)慢速冷凍法的降溫速率(20、40和60℃/min)，復蘇后精子活力、活精子率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性顯著高于快速冷凍法[36]。慢速冷凍法溫度降低速率也不是越快越好[37]?？焖俸吐賰煞N方法均能顯著降低正常精子形態(tài)和DNA完整性的百分比，但兩種方法沒有差異[38]。

2.3.2 玻璃化冷凍法 仍處于探索階段，研究顯示，玻璃化冷凍法不需要冷凍保護劑，活精子比率明顯高于慢速冷凍法，頂體保存較好，DNA碎片平均比慢速冷凍法減少1/3[39-40]。有研究檢索2428篇文章，涉及486個玻璃化冷凍和486個常規(guī)冷凍保存精子樣本(包括慢速冷凍或快速冷凍法)，玻璃化冷凍后解凍精子的總運動活力和前向運動活力明顯更高，但是兩種方法對精子DNA損傷以及形態(tài)的影響無明顯差異[41]。

2.3.3 冷凍干燥法 已經(jīng)被成功用于動物精子的冷凍保存，冷凍干燥法的最大優(yōu)點是，精子樣本可以長期保存在4℃冰箱中，甚至在室溫下保存。將小鼠和大鼠的精子用含有10m M Tris和1m M EDTA的溶液(p H＝8.0)冷凍干燥后，在4℃下可以保存3～5年[42]。在乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)等螯合劑與迷迭香酸(RA)配合使用時，提高冷凍干燥后精子DNA的完整性，但不能夠促進受精和胚胎發(fā)育[43]。

2.4 復蘇方法

現(xiàn)有的復蘇方法主要是37℃水浴，但有研究認為40℃具有更高的冷凍復蘇率，但是復蘇后精子的活力、頂體狀態(tài)、DNA完整性、ATP酶含量沒有顯著改善[44]。2015年有研究者嘗試在38℃、40℃、42℃的不同溫度下孵育5s和10s，經(jīng)計算機輔助精子分析(CASA)和低滲膨脹試驗，顯示42℃水浴環(huán)境中復蘇玻璃化冷凍精子，精子活力和質(zhì)膜完整性更佳[45]。

3 小結(jié)

目前國際上已經(jīng)存在多種人類精子冷凍保存技術(shù)，但每項技術(shù)都存在不同程度的缺陷，其主要表現(xiàn)在冷凍復蘇后精子質(zhì)量不同程度下降。筆者認為，深入了解冷凍復蘇影響精子質(zhì)量的分子機制，創(chuàng)新技術(shù)方法，建立人類精子質(zhì)量分子評價技術(shù)，是解決此難題的重要途徑。